CASO REAL N° 1

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Por mis experiencias en el desarrollo de técnicas inmunoanalíticas cuantitativas, un inmunoensayo es un Sistema Termodinámico Abierto y Homogéneo, dado que las Funciones o Variables de Estado magnitudes físicas macroscópicas– de cualquier parte del sistema son iguales en cualquier porción del mismo, y caracterizan el estado de los sistemas en equilibrio en cada uno de los tubos, pocillos de microplacas y celdas de reacción en un instrumento automatizado entre otros.

Las principales magnitudes físicas macroscópicas de interés del Bioquímico o del Facultativo a cargo del laboratorio de análisis clínicos a tener bajo su control serán:

  • La temperatura (de la reacción, de la incubación y ambiental)
  • La presión (ambiental)
  • El volumen
  • La masa
  • y la Entropía entre otras

Como también se deberá considerar:

  • La humedad ambiental y el déficit higrométrico provocado por la utilización de aires acondicionados.
  • El pH y la Fuerza Iónica en el seno de la reacción entre otras.

Varias de las magnitudes físicas citadas modifican la unión Ag-Ac, algunas podrán estar y otras no, bajo el control del profesional del laboratorio clínico, pero el conocimiento y la consideración de las mismas, le permitirá al profesional aceptar las ventajas y las limitaciones de las variaciones de las Constante de Equilibrio, Afinidad o Afinidad intrínseca promedio de los anticuerpos en la reacción Ag-Ab, interpretar las causas de las imprecisiones y desvíos en distintos analitos por las diferentes metodologías, y si ello puede poner en riesgo o no, la seguridad del paciente, independientemente de los conocimientos, experiencias y saberes sobre en la fisiología, la fisiopatología y la clínica del paciente.

En una técnica inmunoanalítica manual, un error o la falta de interpretación de los protocolos alternativos –como será explicado en un tema real al final de presente caso práctico propuestos por los fabricantes de reactivos en sus respectivos manuales de instrucción, puede llevar a la disminución de los límites de detección y a un aumento de la imprecisión en niveles de concentraciones bajas.

De la misma forma ocurre en un sistema inmunoanalítico automático cuando el profesional –por modificaciones realizadas en el software del instrumento– disminuye el nivel de concentración por debajo del indicado por el fabricante como límite inferior, con la leyenda “menor que X”, se obtendrán resultados con alta imprecisión.

En general, la solución de problemas o situaciones imprevistas requiere una base de conocimientos –teoría y experiencia– que en muchas ocasiones deben resolverse con la utilización de pensamientos creativos, los que el Dr. Edward De Bono, denomina “pensamiento lateral”.

Si por medio del pensamiento lógico o vertical, el motivo del problema es localizado y solucionado rápidamente, se corrige una situación puntual, pero se pierde la posibilidad de solucionar inconvenientes similares que provengan de orígenes diferentes.

Las situaciones que quedaron planteadas al final del caso práctico N° 10 son de distinta índole, y los componentes de los reactivos en los diferentes escenarios –calibradores, estándares o ajustadores, controles de calidad o las muestras de los pacientes– presentaron comportamientos inesperados.

Todos los problemas son diferentes pero tienen algo en común: el comportamiento errático del sistema inmunoanalítico –en condiciones de equilibrio, o no– al que denominé Sistema Termodinámico.

La termodinámica es la más rigurosamente lógica de todas las ciencias; podemos explicar la mayoría de los problemas que pueden ocurrir en una reacción química, enzimática o inmunoanalítica en cualquier metodología, desde un simple test de aglutinación del látex hasta la técnica realizada por el instrumento más sofisticado que podamos imaginar. Las leyes de la física y de la química no se pueden violar; la interpretación de la termoquímica y la termodinámica desempeñan un rol muy importante para la solución de los problemas cotidianos en el laboratorio.

Debo reconocer que en muchas ocasiones –debido al exceso de trabajo que tienen los profesionales en el laboratorio, o la necesidad de dar una respuesta rápida a los protocolos de ensayos y la entrega de resultados– se pueden producir omisiones o errores humanos involuntarios que en ciertos casos, no son fáciles de interpretar o, al menos, con la celeridad que se requiere.

Además, existe un mecanismo de defensa, propio de la naturaleza humana –cuando no se cuentan con las herramientas o con la suficiente cantidad de experiencias vividas– que significa pensar que los problemas vienen de afuera, cuando la realidad indica lo contrario.

En este caso práctico consideré importante mencionar el parecer que tuvo el Dr. Albert Einstein acerca de la termodinámica: Una teoría es tanto más importante, cuanto mayor sea la simplicidad de sus premisas, más diversas sean las cosas que relaciona y mayor sea el área de aplicación. Esa fue la causa de la honda impresión que la termodinámica dejó en mí. Es la única teoría física de contenido universal que, estoy convencido…nunca será desplazada.

La termodinámica es una rama de la física y también, una de las más complejas. Este tema se desarrollará para explicar fenómenos que ocurren en la reacción inmunoanalítica y para la identificación de determinados problemas que pueden ocurrir. No se hará en forma dogmática porque sencillamente no soy especialista en termodinámica, sino desde un punto de vista heterodoxo, ecléctico y con ejemplos aplicables a la vida real.

Significa que muchas afirmaciones serán definidas como medias verdades o, dicho de otra manera, posturas intermedias; nos abocaremos exclusivamente a que los conceptos queden claros y, además, que los fenómenos que ocurren o pueden ocurrir en una técnica inmunoanalítica manual o automatizada, y en cualquier laboratorio; por ello están excluidos algunos conceptos que consideré no aplicables.

Además de mis experiencias personales incluiré las experiencias observadas y obtenidas por otros colegas, con los que cooperé cuando trabajaba en el área científica en una empresa privada. Así, con todas ellas, intentaré concretar el propósito de transmitirlas para cooperar con todos los profesionales para que logren identificar y solucionar problemas dentro de sus laboratorios y en sus condiciones de trabajo individuales o, incluso, para que realicen monitoreos de los laboratorios de alta complejidad cuando tercerizan y confían las muestras de sus pacientes.

Conjuntamente, pretendemos infundir seguridad a los profesionales para la toma de decisiones, su implementación y, especialmente, para ejercer la docencia correspondiente a los médicos, los  pacientes y otros colegas cuando se presentan los interrogantes planteados en el comienzo del caso práctico 10.

Etimológicamente, la palabra termodinámica proviene del griego, θερμo-termo que significa “calor” y  δύναμις- dinamo, significa “fuerza”, que también se puede vincular con movimiento, y veremos que por definición, calor quiere decir energía en circulación o en movimiento.

Esta rama de la física aborda la energía y sus transformaciones en los sistemas termodinámicos (ST), desde el punto de vista macroscópico, y todos sabemos que la energía no se crea ni se destruye, solo se transforma.

En realidad, es la física estadística o la mecánica estadística la parte de la física que trata de determinar el comportamiento de un sistema formado por moléculas; es decir, desde el punto de vista microscópico pero con fines prácticos, expresaré conceptos de fácil percepción.

El análisis de microestados es mucho más complejo que el que realizaré con la utilización de variables macroscópicas, como la temperatura, la presión, el volumen, la masa y el volumen; pero, la finalidad de este caso práctico y los próximos es precisamente demostrar la influencia de esas variables de estado en los diferentes sistemas inmunoanalíticos en las condiciones operacionales del laboratorio clínico.

La relación entre los estados microscópicos y macroscópicos de la termodinámica está dada por el aporte científico de Ludwig Boltzmann, quien a causa de la falta de la demostración de la existencia de los átomos, en la década de 1890, más el rechazo que sufrió por la comunidad científica a su postulado, tal vez fueron factores determinantes para su suicidio en 1906. Solo unos años después de su muerte, los trabajos de Jean B. Perrin, confirmaron los valores del número de Avogadro y la constante de Boltzmann, que convencieron a la comunidad científica de la existencia de los átomos.

Esa es la razón por la cual la definición clásica de termodinámica resulta un tanto controversial cuando se menciona el punto de vista macroscópico, ya que el estudio de nuestro sistema termodinámico [Ag] + [Ac] ↔ [Ag-Ac] llegará a niveles de moléculas y átomos. Este estudio no involucrará la energía de origen nuclear, como en el caso de las técnicas isotópicas, como RIA e IRMA; la emisión radiactiva no participa en la inmuno-reacción primaria Ag-Ac, solo servirá como un marcador, “una bandera” para efectuar las mediciones de lo que sucede en la unidad de test de la reacción.

También, con referencia al punto de vista macroscópico, sostiene que las variaciones deben ser perceptibles a nuestros sentidos, pero no lo será en nuestro sistema, pues podemos ver el movimiento de una máquina de vapor, de un émbolo, el funcionamiento de un aire acondicionado, etcétera, porque son macroestados. Pero con la utilización de moléculas marcadas y la separación de las fracciones de las moléculas sujetas al estudio, se podrá poner de manifiesto de forma indirecta y obtendremos las respuestas o señales que interpolaremos de una curva de calibración que, por diferentes sistemas, puede ser radiactividad, color, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, etcétera.

Es decir, que nuestros sistemas termodinámicos (ST) de interés son las reacciones [Ag] + [Ac] ↔ [Ag-Ac] o [Ac1] + [Ag] + [Ac2] ↔ [Ac1-Ag-Ac2], según el sistema sea competitivo o no competitivo.

Para dar una definición simple y genérica de un sistema termodinámico (ST), acorde con la bibliografía general sobre termodinámica (Gráfico 1), podemos decir que es una porción del espacio, de materia, de sustancia, etcétera; limitada por una superficie regular o irregular, real o imaginaria denominada frontera; allí es donde se sitúa la materia de nuestro estudio y dentro de ese límite nos podemos mover para estudiarla y, en nuestro caso, estará contenido dentro de cada tubo, pocillo de ELISA, IF, celda de reacción de un sistema automatizado, etcétera.

Se denomina medio externo (ME) o entorno el área fuera de la frontera y, la suma del ST + ME se denomina Universo (U). Tendremos en cada ensayo tantos subsistemas termodinámicos (subST) como componentes que participen en la inmuno-reacción primaria, como los estándares o calibradores, los controles de calidad o las muestras que procesemos. También serán ST diferentes, los que se procesen por metodologías diferentes.

Gráfico 1. Esquema general de un sistema termodinámico.

Existen tres tipos de sistemas termodinámicos, sistema abierto (Gráfico 2), sistema cerrado (Gráfico 3) y sistema aislado (Gráfico 4) y su elección dependerá del interés de la investigación.

Gráfico 2. Sistema termodinámico abierto

Hay intercambio de masa y energía con el medio externo.

Gráfico 3. Sistema termodinámico cerrado

Existe intercambio de energía, pero no de masa, con el medio externo.

Gráfico 4. Sistema termodinámico aislado

El sistema termodinámico aislado no existe en la vida real, no permite transferencia de energía y es impermeable a la masa con el medio externo o entorno. Los expertos lo consideran de gran importancia para los estudios de las reacciones que en él podrían ocurrir, pero no es aplicable para la resolución de problemas que se tratarán en este y en los próximos casos prácticos.

El sistema abierto es el sistema propuesto para las reacciones inmunoanalíticas; los componentes están en contacto con el medio externo con los que intercambian energía y materia.

Por supuesto que si observamos las representaciones de los distintos modelos de sistemas termodinámicos (Gráficos 2, 3 o 4) cuyos esquemas están en la mayoría de los libros –con una visión ligera e intuitiva–, puede llevarnos a una conclusión errónea en el planteo preciso de nuestro sistema termodinámico (ST) Ag + Ac ↔ Ag-Ac. Pero ¿por qué sostenemos que es un ST abierto?, por la sencilla razón de la existencia de la complementariedad entre los componentes específicos, el intercambio, o mejor dicho, la circulación de calor que generarán los enlaces no covalentes –producidos por fuerzas electrostáticas débiles– repulsivos y atractivos, y la interacción con el entorno o ME capturando o repeliendo moléculas de agua.

La generación de cambios en la conformación original de las moléculas del subST [Ag] y subST [Ac] previa a la formación del nuevo ST [Ag-Ac] unidos por las fuerzas antes mencionadas, se caracteriza por la Ka del anticuerpo por su antígeno específico y por último, los cambios de las concentraciones molar del complejo en cada contenedor –acorde a la concentración agregada de antígeno presente en los calibradores, estándares, controles de calidad y muestras– a la temperatura, pH y FI del ensayo.

Es necesario que quede claro el concepto del modelo propuesto del ST y del ME para una reacción antígeno-anticuerpo, dado que en ninguna bibliografía consultada hasta el presente lo han definido; no son los pocillos, las celdas de reacción o los tubos de ensayo. El ST y el ME están contenidos en ellos y en cada uno se dispensarán todos los componentes incluidas las muestras, sin embargo en alguna técnica habrá reactivos que estarán fijados en la fase sólida, donde cada uno de los componentes que intervienen en la inmuno-reacción primaria son subST independientes.

De acuerdo con lo expresado en el párrafo anterior, significa que los antígenos marcados, los controles, los calibradores, los estándares, los ajustadores, las muestras de los pacientes, el o los anticuerpos, marcados o fijados al contenedor, serán subsistemas termodinámicos (subST) diferentes, todos y cada uno de ellos, en sus contenedores correspondientes.

Cuando se dispensen los reactivos o las muestras difundirán en forma irreversible completando el volumen final donde se lleva a cabo la reacción. Significa que la homogenización de cada uno tendrá un comportamiento espontáneo e irreversible como el que tiene una gota de tinta en un volumen de agua, y es verdaderamente irreversible, porque no existe ninguna posibilidad de un camino inverso, como que pueda concentrarse la tinta en una sola gota como se dispensó originalmente.

Es decir, el ST final, y de interés para nuestro estudio, resulta de la sumatoria de los diferentes subST individuales; tiene las características de ser un sistema abierto, compuesto por la masa de antígeno y de anticuerpo, limitada por una superficie irregular e imaginaria (por ser proteínas o haptenos solubles en agua) a la que denominamos frontera, todos los componentes en medio acuoso presentes en el contenedor que no participan en la reacción Ag-Ac, incluida la interfase entre la solución y el aire, la denominaremos ME o entorno.

Aquí se puede observar claramente que hay dos ST abiertos bien definidos, los reactivos y los productos en la solución por un lado, y la combinación de la solución y el aire que se encuentra por fuera de la solución por el otro. El modelo propuesto, compuesto de dos ST abiertos, puede ser cuestionado, pero como lo señalé, no soy experto en el tema, leí las apreciaciones de Albert Einstein acerca de la termodinámica, además de leer definiciones de diez autores de libros o publicaciones y obtuve tantas definiciones como autores, en consecuencia, y por propia convicción, propongo mi modelo (Gráficos 5 y 6) porque satisface las necesidades para poder explicar los fenómenos y los problemas que ocurren o pueden ocurrir en la vida real dentro del laboratorio.

Gráfico 5. Modelo del sistema termodinámico abierto propuesto para técnicas inmunoanalíticas competitivas.

Ejemplo: Estradiol, Progesterona, Testosterona, etcétera

Gráfico 6. Modelo del sistema termodinámico abierto propuesto para técnicas inmunoanalíticas inmunométricas

Ejemplo: PSA, hTSH, Prolactina, hFSH, hLH, etcétera

Un sistema inmunoanalítico competitivo (Gráfico 5), el ST final –motivo de estudio– dentro de un contenedor cualquiera para medir 17-β-estradiol (E2), será el anticuerpo anti-E2 más el E2 del paciente, control o calibrador y el E2 marcado con lo que corresponda a la metodología; el resto será el ME. En el caso de un sistema inmunométrico (Gráfico 6), el ST final está formado por los subST Ac1, Ac2 y el Ag presente en el control, calibrador o muestra.

Definido con precisión el modelo del sistema termodinámico, motivo del estudio, y previo a hacer la descripción de los postulados o axiomas denominados que será realizada en los próximos casos prácticos: los cuatro principios de la termodinámica.

Se explicó en varios casos prácticos anteriores, en el análisis cinético de la reacción Ag-Ac, que la Ka o la K de afinidad intrínseca promedio del anticuerpo varía con la temperatura; a menor temperatura se produce un menor estado de desorden y, viceversa. En el equilibrio, acorde con la ecuación ΔG0 = -R T Ln Ka, vincula o aproxima –en el caso de las técnicas inmunoanalíticas– la constante de afinidad del anticuerpo, con el cambio de la energía libre de Gibbs estándar (ΔG0) a una temperatura dada y constante en todo el desarrollo del ensayo.

También se debe recordar, según se expuso en este caso práctico, que hemos definido los viales de controles, calibradores, estándares, muestras y las unidades de test de reacción que contienen antígenos o anticuerpos adsorbidos como diferentes sistemas termodinámicos.

Con la información y los datos expuestos estamos en condiciones de poder resolver algunas cuestiones que tiempo atrás, fueron motivo de reclamos o quejas por supuestas alteraciones en la performance de los reactivos y los instrumentos. Es importante destacar que el análisis de las situaciones que serán planteadas, es válido considerarlas para todas las metodologías, técnicas o marcas comerciales que se basan en la reacción antígeno-anticuerpo.

Las propiedades intensivas y extensivas de la materia que componen los sistemas en estudio, que afectan o influyen en la unión antígeno-anticuerpo, serán descriptas en próximos casos prácticos.

En el siguiente caso real, se observará cómo la propiedad intensiva –aquellas que no dependen de la cantidad de sustancia o del tamaño del sistema– temperatura, afecta la Ka del anticuerpo y la sensibilidad del sistema inmunoanalítico, por afectar las fuerzas débiles que operan en la unión antígeno-anticuerpo.

Situación real N° 1

En el ensayo de estradiol (E2) por RIA en fase sólida de tubo recubierto marca comercial XX, lote N° XX, no se obtuvo la sensibilidad esperada o deseada; el sistema no diferenció el estándar “A” de concentración cero, del estándar “B” de concentración de 20 pg/mL (primer estándar de la curva con concentración de E2). Es importante destacar que en los sistemas inmunoanalíticas competitivos, la falta o la baja capacidad para resolver concentraciones cercanas a la concentración cero “0”, trae vinculada una alta imprecisión intra o entre ensayos en esos niveles de dosis, tema que también será desarrollado en próximos casos prácticos.

Le pregunté a la profesional a qué temperatura incubó el ensayo. El manual de instrucciones del fabricante del producto comercial sugería dos protocolos alternativos de ensayo: en uno de ellos se debía incubar a 3 horas a TA y en el otro, a 1 hora a 37 °C. No es lo mismo cuantificar estradiol a pacientes posmenopáusicas, que cuantificar el estradiol en el caso de estudios para la fertilización in vitro, dado que los valores en concentración buscados son muy diferentes.

La profesional utilizaba la técnica rápida por conveniencia personal, para obtener los resultados en menor tiempo, en 1 hora de incubación a 37 °C. A pesar de que en el diseño del protocolo citado por el fabricante y utilizado por la profesional, se omitía la utilización del estándar “B” para este procedimiento, el fabricante no explicaba en el manual de instrucción el porqué de esa omisión del estándar “B”, las consideraciones acerca de los sistemas termodinámicos ni cómo afecta la temperatura sobre la constante de equilibrio y por consiguiente, la sensibilidad de todo el sistema inmunoanalítico.

Es importante destacar que en el protocolo de 3 horas de incubación a temperatura ambiente (TA), el profesional del laboratorio deberá establecer la temperatura de incubación de forma precisa y constante; no obtendremos los mismo resultados a temperaturas de 17 °C en invierno, o 28 °C en verano, aunque estén comprendidas entre las temperaturas indicadas por el fabricante. Lo ideal es estandarizar los ensayos e incubar a TA a 23 °C durante todo el año y, de no ser posible, tomar conocimiento de las limitaciones propias, no del producto en sí, sino del componente operativo del laboratorio.

Sugerencia. Al quedar claro que los inmunoanálisis son sistemas termodinámicos formados por varios subST individuales, se debe analizar profundamente los protocolos propuestos por el fabricante y desarrollar el ensayo en función de la mejor relación costo-beneficio y mantener las condiciones operativas en el tiempo; los controles de calidad son los que validarán la operatoria.

Con los conocimientos acerca de los diferentes sistemas, además de las experiencias personales, se obtendrá la capacidad de modificar los protocolos –en el caso de una técnica manual– para obtener un mayor beneficio, pero nunca es conveniente innovar, realizar modificaciones o buscar alternativas que persigan la vía de la comodidad laboral personal.

En la siguiente tabla N° 1, correspondiente al analito Estradiol (E2), extraído del reporte Y-A Ligand (Special) Participant Summary - Surveys 2013 del Collegue of American Pathologists (CAP) - Anathomic pathoolgy education programs, se podrá observar una excelente precisión con técnicas automatizadas que era imposible lograr 25 años atrás con técnicas manuales, pero con importantes desvíos entre metodologías, incluyendo pequeños desvíos en la misma metodología entre plataformas de la misma marca comercial que son calibradas con el mismo reactivo.

A mi criterio, las desviaciones observadas no corresponden a causas de la calibración, tampoco considero que sea un requisito obtener un patrón internacional para el Estradiol (E2), dado que su estructura molécular es simple, se puede sintetizar, purificar y pesar con la mayor precisión posible, y por mi experiencia en desarrollos de sistemas inmunoanalíticos manuales de molécula pequeñas simples, tampoco considero que los desvíos en el reporte de QCE se deban a reacciones cruzadas significativas de los anticuerpos, por ejemplo con Estrona (E1) o con Estriol (E3), porque en las muestras de los pacientes se observan desvíos semejantes.

Se puede señalar que las distintas compañías elaboren los reactivos con anticuerpos dirigidos a distintos epítopes de la molécula del Estradiol (E2), pero también es de destacar que una de las empresas desarrolló dos juegos de reactivos, cada uno dirigido a los distintos epitopes y no se verifican desvíos entre ellos.

Por mi firme convicción, esa causa me lleva a pensar que se debe a la diferencia de los distintos Sistemas Termodinámicos que representan las diferentes metodologías, plataformas, reactivos y marcas comerciales, detalles que amplié en el Caso práctico N° 7[1] con el Estradiol y en el Caso práctico N° 16[2], tomando como modelo lo que sucede en términos de desvíos con los reportes de la PTH intacta del CAP-SURVEY del año 2012.

Esta observación y sus causales no fueron documentadas por el Dr. Roger Ekins, cuando afirmó en el año 1991 que los sistemas inmunoanalíticos para antígenos heterogeneos jamás podrán ser estandarizados[3] y por lo observado en la tabla N° 1, para los antígenos homogeneos también resultará muy dificil, y concluyo expresando por la seguridad del paciente la necesidad de que cada laboratorio clínico deberá obtener sus propios valores de referencia (VR) para las diferentes condiciones fisiológicas y fisiopatológicas de los pacientes en sus propios instrumentos, y ejercer la docencia con los profesionales médicos, y la contención de la ansiedad de los pacientes, cuando realizó sus análisis del control de su dolencia en dos laboratorios diferentes.

Tabla 1: Fuente: Survey 2013 - Anatomic Pathology Education Program – College of American Pathologists EE.UU.

Para observar las implicancias de la magnitud física: Temperatura, ir al Caso Real N° 2

Bibliografía:

  1. Caso práctico N° 7: "El conocimiento metodológico es el pilar fundamental del bioquímico para desarrollar oportunidades y posicionamiento profesional" - leer más
  2. Caso práctico N° 16: "Cómo nace un paradigma en el laboratorio clínico - Medición de la PTH intacta" - leer más
  3. Ulf-Håkan Stenman, "Immunoassay Standardization: Is It Possible? Who Is Responsible? Who Is Capable?" - Clinical Chemistry 47, No. 5, 2001 - leer más

Autor: Dr. Eduardo E. Castellani