CASO REAL N° 2

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En este caso práctico, proponemos resolver un interrogante importante que en determinados contextos, afectan a los reactivos, calibradores, controles o muestras y por consiguiente, a los resultados clínicos.

En el caso real que trataremos a continuación, se observará cómo utilizando un control de calidad interno, comercial y multiparamétrico o bien preparado en el laboratorio, se pueden obtener valores de concentración superiores, iguales o inferiores –en los distintos analitos– a los obtenidos e indicados por el fabricante del mismo en el caso que sea comercial o a las medias obtenidas por el profesional en el caso que sea preparado, para una metodología manual o automatizada, marca comercial e instrumento determinado.

Es importante recordar como fue señalado en el caso práctico 8, los diferentes valores de concentración de todos los analitos contenidos en el control de calidad interno –para un mismo lote de fabricación– para las diferentes metodologías, las marcas comerciales y los distintos modelos de instrumentos, y además, el fabricante indica en el protocolo de cada lote que los valores sólo deben considerarse como referencia. A modo de ejemplo puede observarse el protocolo del producto de la compañía BIO-RAD, Lyphoteck™ Immunoassay Plus Control, Level 1, 2  and 3 lot N° 40210. Leer protocolo

Para dar respuesta al interrogante propuesto, nos vamos a apoyar en un tema de las ciencias básicas.

Si aplicamos una fuente de calor constante a una porción de materia, esta última ¿siempre aumentará su temperatura?

Es una excelente pregunta cuya respuesta puede ser , y también, NO.

Si la porción de materia –sistema termodinámico– se halla en una sola fase, por ejemplo, un líquido como agua al estado líquido, la respuesta es , pero si la materia en estudio se halla en 2 fases, equilibrio sólido-líquido como hielo-agua líquida, la temperatura NO aumentará.

Gráfico 1. Representación de las tres fases del agua

Aporte de una fuente de calor constante, Temperatura = f(Tiempo).

Con la interpretación del gráfico 1 que representa los tres estados del agua, estaremos en condiciones de poder resolver algunos problemas cotidianos que ocurren en el laboratorio clínico.

Si disponemos de un sistema termodinámico formado por un cubo de hielo extraído de un freezer a la temperatura de -20 °C (253 °K) es decir, agua en estado sólido a -20 °C y le aplicamos una fuente de calor constante, la energía que tomará el hielo de la fuente de calor la utilizará para incrementar su temperatura hasta llegar a 0 °C (273 °K), representado por la zona F1 del gráfico.

Cuando el hielo alcanzó la temperatura de 0 °C, comenzará a derretirse y no incrementará su temperatura porque corresponde a la zona de calor latente de fusión del hielo.

Con el aporte constante de energía, representado en la zona F2, el calor hará fundir el hielo y se mantendrá un equilibrio entre el agua al estado sólido y el agua al estado líquido. Como en el próximo caso práctico describiré las funciones termodinámicas, por ahora diré que el agua sólida como es el hielo, cuyas moléculas se hallan en un estado cristalino y ordenado, el aporte de calor hará que las moléculas de agua al estado sólido se transformen a un estado de mayor entropía o mayor desorden, aumentando la energía cinética y potencial de las moléculas, es decir, agua líquida.

Mientras exista una mínima cantidad de hielo en equilibrio con el agua líquida, la temperatura no superará los 0 °C al nivel del mar y a 760 mm Hg. Como no hay reacciones inmunoanalíticas que se desarrollen a 0 °C, no ampliaré más sobre este tema, pero, quien desee extender estos conceptos los podrá observar en el vídeo en español “Entropía” del Dr. David. L. Goodstein del California Institute of Technology – EE.UU. Ver vídeo

Cuando se haya disuelto todo el hielo y nuestro sistema termodinámico quede formado en una sola fase por agua líquida, con el continuo aporte de energía calórica constante, la energía absorbida por el sistema hará que el agua aumente su temperatura, como puede observarse en la zona de la F3 del gráfico y, lo realizará hasta que llegue a los 100 °C (373 °K). En esa zona de la representación (F4 del gráfico 1) a la presión atmosférica, la temperatura no se incrementará porque está en la zona de calor latente de ebullición, el agua líquida estará en equilibrio con las moléculas de agua al estado de vapor, y la temperatura permanecerá constante hasta que se evapore totalmente el agua.

Las zonas de interés para analizar problemas que ocurren, o pueden ocurrir en el laboratorio clínico, estarán cuando las temperaturas estén comprendidas entre 4 y 37 °C, región 1 (R1) dentro de la zona F3 y en la región 2 (R2) en la zona F4, en casos puntuales y precisamente cuando se requiere realizar una hidrólisis de los reactivos, controles de calidad o muestras, en baño de agua hirviente.

Hay un concepto muy importante a tener en cuenta, es la situación es el equilibrio agua líquida-vapor de agua en cada punto de las temperaturas comprendidas entre 4 y 37 °C, y otra muy diferente es el equilibrio agua líquida-vapor de agua en la zona del calor latente de ebullición; es decir, diferenciar la evaporación del agua que se produce en los calibradores, controles y muestras en las condiciones de presión y temperatura del laboratorio entre 4 y 37 °C, de la evaporación por ebullición del agua a 100 °C y a nivel del mar.

Se puede ilustrar este concepto con el siguiente ejemplo: las prendas mojadas y colgadas en un tender para su secado a la temperatura ambiente, se secan sin necesidad de que el agua de las prendas requieran estar a la temperatura de ebullición; el agua absorbida en las prendas no hierve (al menos yo nunca vi que el agua burbujeara a una temperatura de 100 °C sobre una prenda).

Las moléculas de agua al estado líquido de las prendas toman energía de ME, produce el aumento de su energía potencial y pasan al estado gaseoso; se establecen equilibrios entre el agua líquida y el vapor de agua, una tenue brisa desplazará las moléculas en estado gaseoso, se generarán nuevos equilibrios, y por último, las prendas se secarán. Por supuesto que las modificaciones en el equilibrio y la velocidad del secado de las prendas dependen de la cantidad de agua en estado líquido, la temperatura ambiente, la presión atmosférica, la humedad del aire, del déficit higrométrico y de la intensidad del viento. Un proceso similar ocurre en la evaporación de los reactivos, los calibradores o estándares, los controles de calidad y las muestras de los pacientes en los laboratorios clínicos.

Las temperaturas que se puede controlar mejor en el laboratorio son precisamente 4 - 8 °C cuando se incuba una reacción en una heladera o en un refrigerador, y a 37 °C, en un baño de agua termostatizado, aunque en este caso además, se deben tener ciertos recaudos en la distancia entre la base de los tubos y la resistencia o fuente calórica, si el baño utilizado no tiene agitación permanente.

El mayor inconveniente ocurre en incubaciones a temperatura ambiente (TA); muchos fabricantes de reactivos de utilización manual indican temperaturas de incubación entre 17 y 28 °C, otros fabricantes de reactivos para procesar en equipos automáticos, indican en los manuales de instrucción que el instrumento deberá funcionar entre las temperaturas de 15 y 30 °C aunque la temperatura de incubación de las reacciones en un instrumento automático en muy precisa y uniforme; la importante omisión en los manuales de instrucción son, la variación de la sensibilidad, los valores de las respuestas y los resultados de las concentraciones obtenidas cuando se realiza el proceso entre las diferentes temperaturas del rango propuesto.

Con respecto al funcionamiento de los instrumentos automatizados a TA, ellos están regulados a una determinada temperatura de incubación, no ocurren demasiados problemas, pero si la reacción se desarrolla a temperatura ambiente y, por supuesto, a la presión atmosférica, la situación se complica en la reproducibilidad de los resultados por causa de la evaporación, cuando se procesa una misma alícuota de control de calidad o muestra, en días y temperaturas diferentes y no ocurre lo mismo con respecto a la precisión, cuando se procesan los calibradores, los controles o las muestras por duplicado.

Quiero significar que los duplicados de cada par de tubos de los calibradores, controles de calidad o muestras pueden ser muy precisos entre ellos en los diferentes días, pero desviados entre los diferentes ensayos, cuando la misma alícuota es procesada en diferentes días, producto de la evaporación de las mismas.

Como sugerencia, se deberá utilizar una nueva alícuota almacenada en la heladera o freezer, cada vez que requiera realizar una nueva calibración, el seguimiento de los valores de los controles de calidad o la confirmación del valor de la dosis de la muestra de un paciente.

Caso real N° 2

Correspondiente a la situación N° 5 del caso práctico 10.

Los valores porcentuales que expondremos fueron magnificados y a modo de ejemplo, para la mejor comprensión de las diferentes situaciones.

"Un profesional a cargo del área inmunoanalítica con automatización total, partiendo de los tres niveles de QC del analito “X” con relaciones (Observado/Esperado) con porcentajes de 99%, 101% y 100%, respectivamente, al llegar a la finalización del tiempo en que el fabricante establece realizar una nueva calibración del reactivo “X”, se obtienen las relaciones (O/E)% de 121%, 119% y 120%, correspondientes a los valores en concentración de los controles de calidad bajo, medio y alto, respectivamente. Las concentraciones del analito “X” de las muestras de los pacientes no difieren estadísticamente de las medias históricas para la misma población, por lo que podemos decir que no sufrieron variaciones los valores de referencia del laboratorio para el analito “X” y con ello podemos descartar un problema de calibración."

Los controles de calidad son multiparamétricos y los produce una importante empresa comercial.

Una vez identificados y establecidos los valores que –a modo de referencia– indica el fabricante para la metodología, el modelo de instrumento y la marca comercial de reactivos utilizada, los valores de las relaciones porcentuales entre los observados y los esperados inicialmente eran de alrededor del 100%.

Estos resultados indicaban que los valores de concentración que obtenía el profesional, estaban en el orden de los indicados por el fabricante. En la utilización de la misma alícuota del control, se fue visualizando un leve desvío con el aumento de la concentración de los controles y cuando se realizó una nueva calibración del analito “X”, los valores de los controles de calidad arrojaban una concentración superior y cercana al 20% de los valores obtenidos inicialmente, sin la modificación de los valores de referencia.

Personalmente sugiero que deberán tener todos los recaudos tal que los controles de calidad carezcan de error; se debe tener una dedicada atención en la preparación y el almacenamiento. La calibración de un analito en un instrumento automático o la realización de la curva estándar en un ensayo manual representa la ruta por la que circulamos, pero los controles de calidad indican en qué kilómetro de esa ruta estamos situados, para dar un ejemplo.

Un incremento del 20% en la concentración de los controles de calidad puede deberse a distintas causas; pueden ser el deterioro de la hormona del calibrador, un exceso de agua agregado en la preparación de los calibradores si la presentación de estos es liofolizada o, precisamente, un deterioro de la hormona contenida en los controles de calidad.

Cuando se efectúa una recalibración, por causa de la alteración de los calibradores como en los primeros dos casos citados en el párrafo anterior y suponiendo la ausencia de error de preparación, conservación o deterioro en los controles de calidad, obtendríamos un incremento en la concentración de los mismos pero también, un desvío de los valores de referencia de los pacientes para el analito “X”, pero no debería observarse dicho desvío en los demás analitos que están contenidos en los controles de calidad multiparamétricos.

Estos casos representan experiencias personales y las he extraído de la vida real, como los valores de referencia de los pacientes para el analito “X” no tenían variación, le pregunté al profesional acerca de los valores de concentración de los demás analitos contenidos en los mismos controles.

Del análisis de los demás analitos surge que de algunos de ellos, se obtenían concentraciones más  altas, de otros, más bajas y, de unos pocos se obtenían las concentraciones propuestas por el fabricante.

Con esos datos y por comentarios sobre la conservación y la reutilización de las mismas alícuotas de los controles de calidad, se concluyó que el deterioro fue por evaporación por el mal almacenamiento.

Este es un típico ejemplo cuando se reutilizan las mismas alícuotas y además, se dejan a TA destapadas. El envase que aloja un control de calidad es también un sistema termodinámico, tal como fuera descripto en el caso práctico 11; acorde con el gráfico 1, se puede experimentar una evaporación y lo que precisamente se evapora es agua, hecho que conlleva a un aumento en la concentración.

Pero ¿por qué la concentración de algunos analitos se mantenía en los valores establecidos por el fabricante y la concentración de otros eran menores? Esta respuesta está vinculada con la estabilidad de las diferentes hormonas. Si hubiésemos visto una contaminación bacteriana en los viales de los QC, nos orientaba inicialmente a un deterioro, pero no existía tal contaminación.

El aumento de concentración de algunos analitos se debió a que eran muy estables en condiciones ambientales y fueron afectados por la evaporación de agua, pero otros, no tanto, con lo que compensó la evaporación del agua con un deterioro parcial de los analitos y por último, las hormonas más inestables mostraron una disminución en la concentración.

Sugerencia. La preparación, la calidad del agua para la reconstitución y la conservación de los controles de calidad internos es fundamental para validar los ajustes o calibraciones de los analitos en un sistema automatizado, y las curvas dosis-respuestas, en las técnicas manuales.

Si la presentación de los controles de calidad es liofilizada, luego de ser reconstituidos con agua (tema que se tratará en el próximo caso práctico), deben ser divididos en alícuotas de volúmenes pequeños y almacenados en freezer a una temperatura de -20 °C, salvo expresa indicación del fabricante.

Se deben utilizar las fracciones en el día y descartarlas. Si algún otro analito contenido en la misma alícuota debe ser controlado con diferencia de horas, el vial debe almacenarse cerrado en la heladera, a temperatura de 4 a 8 °C.

Las alícuotas no deben estar expuestas destapadas a TA más de 20 minutos, y si la temperatura ambiental del laboratorio está regulada a 23 °C por aire acondicionado con frío o con calor, deberán estar alejadas de las corrientes del aire de baja humedad que son generadas.

El equilibrio se verá forzado al pasaje de las moléculas de agua del estado líquido al estado de vapor, y con ello aumenta la probabilidad de que las moléculas de agua al estado de vapor sean arrastradas por las corrientes de aire, se produce evaporación y en consecuencia, el incremento de la concentración. De la misma manera puede suceder con los estándares, los calibradores o las muestras que, por supuesto, conllevarán a resultados y situaciones diferentes que serán explicados en los próximos casos prácticos.

Esta situación real, ocurrió y puede ocurrir de forma independiente de las metodologías, marcas comerciales, técnicas manuales o automatizadas empleadas. Esta situación o error en la conservación de los controles de calidad, no es patrimonio de las técnicas inmunoanalíticas y puede ser extensiva a cualquier técnica de química clínica.

Autor: Dr. Eduardo E. Castellani

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