CASO REAL N° 3

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“El kit de DHEA-Sulfato anda mal, esta marca comercial no funciona o el lote salió mal, quiero que me cambien los reactivos por otro lote. Yo soy especialista en endocrinología y se que los valores obtenidos por este instrumento son aberrantes, los controles de calidad internos dan cualquier cosa, el control de calidad externo fue rechazado y los médicos se quejan porque estoy informando todos los valores altos". - Fueron los comentarios de una profesional a cargo de la sección de hormonas de una unidad hospitalaria, un tanto molesta por la situción. De acuerdo con la segunda situación planteada en el final del caso práctico 10.

Es de destacar que no existen las condiciones ideales o “celestiales” y el profesional o facultativo del laboratorio clínico está trabajando en las condiciones reales o "terrenales". Todas las posibilidades de fallo –humanos y accidentales, o por causas inherentes al sistema de reactivos– deben ser tenidas en cuenta, analizadas y nunca descartar ninguna.

Solamente el conocimiento, definido como la sumatoria la información más las experiencias propias y de terceros colegas, tanto en la clínica médica, en el estado fisiológico y fisiopatológico del paciente, como también saber qué es lo que ocurre dentro de un tubo de ensayo, un pocillo de microplaca o en una celda de reacción en un instrumento automatizado, y como transcurre la reacción.

Para un asesor científico de una compañía proveedora de reactivos de diagnóstico in-vitro e instrumentos, le puede resultar frecuente escuchar del profesional a cargo del laboratorio, cuestionamientos acerca de la mala performance de los reactivos como los descriptos al comienzo del presente caso real.

Lo primero que se debe conocer, es precisamente lo que ocurre en todo el mundo, vinculado con los desvíos entre todas las metodologías, plataformas y incluso por otras causas, pequeñas diferencias entre instrumentos de igual modelo para un mismo control o para una misma muestra del paciente, y en absoluto significa que algún instrumento o reactivo no tenga la performance esperada.

A continuación se podrá observar en la tabla N° 1, los datos de dos controles externos correspondientes al DHEA-Sulfato, informados por laboratorios de EE.UU., correspondientes al primer cuatrimestre del año 2013 del Control de Evaluación Externa del CAP-Survey del Collegue of American Pathologists de EE.UU., semejante en la correlación de los desvíos entre las metodologías y plataformas, como también sucede en los reportes del Programa de Garantía Externa de la Calidad de Bioquímica de la Sociedad Española de Química Clínica y Patología Molecular (SEQC) y en todos los demás programas más prestigiosos de QCE del mundo.

Tabla 1: Fuente: Survey 2013 - Anatomic Pathology Education Program – College of American Pathologists EE.UU.

La profesional que reclamó por la mala performance de los reactivos del DHEA-Sulfato, reconstituyó el set de dos calibradores o ajustadores liofilizados de niveles de concentraciones baja y alta con agua destilada, que correspondían a un nuevo set de reactivos para proceder a su calibración en el instrumento automatizado “X”. Simultáneamente, al efectuar la calibración procesó tres niveles de controles de calidad internos (QCI) y obtuvo valores de concentraciones más elevados que los esperados; lo que motivó a la profesional a escalar un reclamo a la compañía comercializadora.

Este hecho sucedió a finales de la década de 1990, cuando trabajaba para una compañía distribuidora de reactivos de diagnóstico In-Vitro. Ante ese reclamo me dirigí al hospital para interiorizarme del problema y cooperar con la profesional. Con los valores en unidades de concentraciones de los controles de calidad obtenidos, calculé las relaciones entre los valores observados con los valores esperados, y detecté un desvío (bias) uniforme en los tres niveles de los controles, donde las relaciones (O/E)% resultaron de 199%, 201% y 200% correspondientes a los niveles de concentraciones baja, media y alta respectivamente.

Así también, presté atención a un desvío del 200% –respecto a los valores de referencia establecidos en el laboratorio– en los valores de concentraciones de las muestras de los pacientes, con ausencia aparente de patologías. Los parámetros logísticos de la curva en el reporte de control de calidad del lote del kit informada por el fabricante, no daba indicio que hubiese habido reformulaciones del reactivo con respecto a los lotes anteriores; no obstante, percibí que la pendiente del ajuste realizado en el instrumento, representaba un valor superior a los obtenidos comparados con lotes anteriores del mismo reactivo.

La profesional preguntó si podía haber existido un inconveniente en el kit de DHEA-Sulfato, lote N° xxxx, y ante mi respuesta negativa de que podría deberse a un problema del fabricante, pidió el reemplazo del producto, solicitud a la que atendió la empresa proveedora.

La calibración del kit fue realizada en cuatro oportunidades y se obtuvieron resultados similares y, además, fue rechazado el control de calidad externo del laboratorio para esa determinación, por superar las cuatro unidades de desvío, correspondientes a la media general y a su metodología, en particular.

¿Cuáles fueron las posibles causas para obtener altos valores de concentración de DHEA-Sulfato?

Previo a la descripción de la situación vinculada con el DHEA-Sulfato por una técnica inmunoanalítica automatizada, describiré un ejemplo similar con un analito como la glucosa, que ayudará y facilitará la comprensión.

En el caso práctico 10, definí que un resultado clínico está compuesto por cinco factores: los reactivos, el instrumento, el profesional, la muestra y un factor de difícil ponderación, al que denominé Xfiles que, cuanto mayor sea el conocimiento del profesional de los procesos, menor será el último factor.

Al sistema de reacción o termodinámico –sea una reacción química, enzimática o inmunoanalítica– le importa poco el valor de concentración indicada en los rótulos de los envases de los calibradores, los estándares, los ajustadores o en los controles de calidad, pero si, esos valores informados por el fabricante, se deberán ingresar manualmente, o por la lectura de los códigos de barras para que la computadora realice el procesamiento de los datos.

Las reacciones y sus correspondientes respuestas en densidad óptica, radiactividad, relación de fluorescencia, o las unidades que fueren, provenientes de los diferentes sistemas manuales o automatizados, serán proporcionales a la cantidad de moles del analito que participen en la reacción.

La diferencia entre las reacciones químicas de las enzimáticas e inmunoanalíticas, radica en que en las primeras existe una modificación directa de las estructuras químicas, que son las que producen la respuesta. En las reacciones enzimáticas o inmunoanalíticas, solo hay interacciones electromagnéticas atractivas y repulsivas, como las fuerzas de van der Waals, los puentes de hidrógeno, las fuerzas iónicas y las hidrofóbicas, a excepción de los cambios químicos secundarios, producidos en las metodologías basadas en la generación de productos o señales lumínicas que se producen por el agregado de peróxido de hidrógeno en medio alcalino, por la catálisis enzimática de la fosfatasa alcalina o por la exposición a un campo eléctrico en que la Tripropilamina (TPA) actuará como donor de electrones, cambiando el estado de oxidación del complejo de Rutenio-2 a Rutenio+3, generando una respuesta lumínica.

Por supuesto que elaborar un informe para el médico o para otro colega, no resulta práctico informar los datos con la cantidad de moles o unidades internacionales que están contenidos en el tubo o celda de reacción que corresponden a las muestras de los pacientes, por el simple hecho que los diferentes analitos o los mismos de distintas marcas comerciales, utilizan volúmenes de calibradores o estándares, controles de calidad y muestras diferentes, a excepción de que el médico conozca el volumen de muestra que se ha utilizado, el volumen final de incubación, el peso molecular del analito, entre otros datos, y ellos realicen los cálculos en concentración.

Por esa razón, se justifica la simplicidad del informe en unidades de concentración, cualquiera sea, por convención internacional o las propuestas por la bibliografía; pero, si deseáramos informar un valor de glucosa en unidades g/L, mg/mL o tonelada/metro cúbico, no afectaría la interpretación clínica.

En cuanto al tema de la cantidad de moles de glucosa dentro del tubo o celda de reacción, sí es de vital importancia. Si tuviésemos un calibrador liofilizado de glucosa, cuyo rótulo indica 1 gramo/litro y debe ser reconstituido con 1 mL de agua destilada y, en vez de adicionar ese volumen –por distracción u otra causa– agregamos 2 mL de agua, la cantidad de moles de glucosa presentes por unidad de volumen se reduce a la mitad y es independiente a lo indicado en el rótulo del envase. Ese es un hecho relevante.

Como las reacciones se llevan a cabo con los volúmenes acorde con las indicaciones del fabricante en una técnica manual o, con el volumen a dispensar programado por el fabricante en el sistema automatizado, la representación de los valores de las respuestas, sea una gráfica manual, por computadora o por el procesamiento de cálculos de los instrumentos, se generará un factor numérico de conversión, y se considerará que la concentración de glucosa en el calibrador es de 1 gramo/litro; pero, en realidad, la respuesta será proporcional a la cantidad de moles presentes por unidad devolumen, o lo que es lo mismo, la cantidad de moles en el volumen final de incubación, y ese valor es exactamente igual a la mitad.

Cuando procesemos en ese ensayo los controles de calidad y las muestras que presenten la concentración que realmente tienen, el valor de concentración obtenido por interpolación de una gráfica o por el cálculo realizado por la computadora del instrumento, será exactamente el doble de concentración. Ello es porque el calibrador dice tener en su rótulo 1 gramo/litro pero, verdaderamente tiene la mitad, es decir, que la cantidad de moles agregados en el volumen dispensado es la mitad, y la respuesta que obtendremos será correspondiente a la cantidad de moles presentes; si una muestra de un paciente o un control de calidad, tiene verdaderamente 1 gramo por litro, resultará como que tiene 2 gramos/litro.

Es importante comprender que el conjunto de calibradores o estándares de un sistema analítico representa la ruta por donde circulamos o nos dirigimos, mientras que los controles de calidad nos indican en qué kilómetro de esa ruta estamos circulando. En todos los sistemas, las concentraciones de los controles de calidad y las muestras de los pacientes, son obtenidas por interpolación de la curva de calibración.

Este ejemplo con datos numéricos puede resultar trivial, pero el resultado es similar cuando existe un deterioro del analito en los calibradores; por supuesto que no será una disminución de la mitad de los moles para obtener concentraciones del doble de las muestras y controles, pero puede darnos una valiosa información cuando observamos un desvío hacia una misma dirección de todos los resultados obtenidos, cuyo ejemplo real será explicado más adelante.

Para la resolución y la explicación del problema de los resultados del DHEA-Sulfato, efectuaré la descripción de mis experiencias y errores personales en el desarrollo de sistemas inmunoanalíticos.

A finales de la década de 1980, trabajando en la Universidad en el desarrollo de kits de T3 Total y T4 Total por radioinmunoanálisis. Luego de pasar por sus distintas etapas, los reactivos estaban siendo evaluados por distintos laboratorios clínicos y, personalmente desarrollaba –en el laboratorio de la Cátedra de Radioisótopos– ensayos en forma diaria para evaluar la performance, la estabilidad del conjunto de los reactivos, los parámetros de la curva dosis-respuesta en cada ensayo y los valores de la concentración de los controles de calidad, hasta la fecha de expiración propuesta para ambos kits. Los controles de calidad estaban compuestos por pooles de sueros y un set de controles comerciales multiparamétricos en tres niveles de concentración.

Todos los días desarrollaba en forma simultánea el ensayo de T3 Total y T4 Total; al efecto seleccionaba los calibradores y los demás reactivos, como el trazador, el anticuerpo, los controles de calidad y el sistema de separación de la fracción libre de la unida. En una oportunidad, en el ensayo de T3 total, los valores de los controles de calidad en todos sus niveles, arrojaron valores de concentración mucho más altos que el esperado, y el análisis de la unión máxima realizada con el estándar cero de concentración no tuvo modificaciones, existía una leve disminución en el parámetro correspondiente a la unión inespecífica, un corrimiento importante de la D50 hacia valores más altos que su valor histórico y una marcada disminución de la pendiente de la curva dosis-respuesta, observaciones que no se obtuvieron en el ensayo de T4 Total, cuyo comportamiento coincidió con el habitual.

En ese momento, yo no había reconstituido ningún reactivo, los calibradores de T3 Total y de T4 Total eran los mismos que los utilizados los días anteriores, donde ambos ensayos tenían los  comportamientos esperados. Pero, ¿Qué sucedió realmente con ese ensayo de T3 Total?

A diferencia del modo de pensar de los profesores que he tenido en las materias de análisis clínicos; ellos sostenían que si un ensayo fallaba, debía tirar todo y comenzar nuevamente, tal como lo hizo la profesional que trabajaba en la calibración del kit de DHEA-Sulfato en el sistema automatizado “X”; ella realizó la calibración en cuatro oportunidades y obtuvo los mismos resultados.

Efectuar una calibración o un ajuste en un sistema automatizado, no es un acto de magia, tampoco significa el reordenamiento de reactivos mezclados o armar un rompecabezas o puzzles de 10.000 piezas, significa simplemente –con los reactivos provistos por el fabricante– ajustar las condiciones de cálculo obtenidas por el fabricante para cada analito y lote en particular, y adaptarlas para nuestro instrumento para interpolar las muestras incógnitas en la curva dosis-respuesta, realizada por el fabricante.

Mi actitud frente a los resultados obtenidos con el ensayo de T3 Total fue totalmente diferente, la composición de los estándares no podía cambiar ni disminuir el número de moles por unidad de volumen en forma importante de un día para otro, y las condiciones de almacenamiento de los reactivos tampoco habían variado. ¿Podía ser un problema de los sets de controles de calidad? Ello fue descartado por la similitud del comportamiento en términos de las respuestas obtenidas y la estabilidad de moléculas similares, como son la T3 y la T4 contenidas en los controles y, por otra parte, ambos controles contenían los dos parámetros y el ensayo de T4 Total no tuvo inconvenientes.

El set de estándares que había desarrollado para el ensayo de T3, constaba de las siguientes concentraciones, 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 y 800 ng/dL y los estándares de T4 eran 0, 0,31, 0,62, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 y 40 mg/dL. En un apartado explicaré el motivo de la utilidad de los estándares de bajas concentraciones, de nulo interés para la clínica humana.

Los estándares para los ensayos de T3 total validados para humanos constaba de siete concentraciones, 0, 25, 50, 100, 200, 400 y 800 ng/dL y eran los mismos viales que utilizaba a diario pero, ese día en particular, tomé el estándar cero y por descuido, pensando que el segundo estándar era de 25 ng/dL, tomé el correspondiente a 12,5 ng/dL, y luego los sucesivos hasta completar toda la serie de siete estándares.

Eso fue lo que sucedió, procesé los estándares con el desfase de una dilución menor, pero en el procesamiento de los datos, en los cálculos consideré al segundo estándar de 25 ng/dL de concentración.

Como fue explicado, los anticuerpos del sistema inmunoanalítico reconocen el número de moles que fueron dispensados en el seno de la reacción y no lo que suponemos; por consiguiente, en todos los niveles de los controles de calidad obtuve valores del doble de concentración.

Además de tener en cuenta la frase célebre de Albert Einstein, acerca de lo que consideraba como infinito, los colegas pueden observar que el resultado obtenido era equivalente al que hubiera obtenido reconstituyendo los calibradores con el doble volumen de agua, suponiendo que hubiesen estado liofilizados.

Verificado el error cometido, procesé nuevamente los datos con la computadora asignando los valores correctos de los estándares, así, los resultados fueron sorprendentes, y ese error me aportó informaciones muy valiosas. Debemos apreciar que los errores están dentro del proceso del aprendizaje.

Las respuestas de radiactividad de los tubos del ensayo de los controles y los estándares con las concentraciones correctamente asignadas, se correspondían con los ensayos anteriores, la relación de los valores de concentración (no de los valores de respuestas) observado/esperado fue exactamente 2 en todos los niveles, con lo que podían corregirse los valores de concentración con ese factor y además, ponía de manifiesto la inconsistencia de algunas de las reglas de Shewhart correspondiente a los desvíos, muy de moda en aquellos años para evaluar si se descartaba o no un ensayo.

Al año siguiente, en 1990 tuve la posibilidad de asistir a un curso internacional dictado en Asunción del Paraguay, organizado por la International Atomic Energy Agency (IAEA) sobre: “Control de calidad de las técnicas radioinmunoanalíticas”.

Cuando un profesor de la IAEA, hizo una revisión de las reglas de aceptación y rechazo de los ensayos, a la luz de mis experiencias, hice una observación de la validez o inconsistencia de ciertas reglas, que estaban muy arraigadas en el ámbito profesional del radioinmunoanálisis. En tres oportunidades el profesional refutó mis conclusiones y mis consideraciones. Cuando finalizó la clase me dirigí a él con los datos experimentales en la mano y me dijo que yo tenía razón, pero no podía aceptarlos frente a todo el auditorio. ¿Se debía a un efecto de paradigmas de los profesionales del RIA de aquellos años?

A mediados de la década de 1990, ya trabajando en una compañía de reactivos de diagnóstico, un profesional especialista en endocrinología que realizaba técnicas de RIA con mucha experiencia, me consultó sobre la dudosa performance de un kit de prolactina por IRMA, y me comentó que todas las muestras de los pacientes daban concentraciones altas, incluidos los controles de calidad internos. Le pregunté cuántos niveles de controles había realizado y me dijo tres, con la finalidad de monitorear la totalidad de la curva de calibración.

Le solicité los valores de concentración de los controles de calidad obtenidos en ese ensayo y los valores esperados, la relación entre los datos [O/E]% arrojaron valores cercanos al 30% en los tres niveles de concentración. Fue un caso similar a los anteriores, la disminución de la cantidad de moles porunidad de volumen de prolactina presentes en la curva de calibración; los datos de los pacientes fueron corregidos y no fueron informados. Cuando recibió un nuevo reactivo procesó otra vez las muestras y los controles con un nuevo kit y los resultados obtenidos se reflejaron iguales a los datos corregidos del ensayo anterior. Además, a pesar de no estar indicado en el manual de instrucciones del producto la temperatura de almacenamiento de los calibradores de prolactina, le sugirió dividir los calibradores en alícuotas, almacenarlas a -20°C en freezer, y descongelar una fracción cada vez para ser utilizados en cada ensayo.

Volviendo al problema que tuvo la colega con las muestras y controles de DHEA-sulfato, planteado al comienzo de este artículo, el problema se debió a la reconstitución de los calibradores o ajustadores con el doble del volumen de agua que el indicado por el fabricante del reactivo, hecho que demostré pidiéndole una pipeta de vidrio de 2 mL; ella había realizado cuatro calibraciones llenando las copas contenedoras, con aproximadamente 0,5 mL cada una, lo que resultaba un total utilizado de 2 mL, levantando cuidadosamente el volumen de los viales de los calibradores o ajustadores, quedaba un remanente de 2 mL en cada vial, y le observé que el fabricante indicaba en el rótulo del envase, “Reconstituir con 2 mL de agua destilada”

Conclusiones: ante resultados de concentración de un paciente, de un analito cualquiera, debemos tener el conocimiento para poder evaluar diferentes situaciones o escenarios y tener la creatividad para encontrar los errores, si los hubiera, y las posibles soluciones; además, es el conocimiento la fuente inspiradora y motivadora para el crecimiento y posicionamiento profesional.

Muy lejos están mis paradigmas de los colegas que sostienen que las nuevas funciones del bioquímico o facultativo del laboratorio clínico como director responsable, es deberse exclusivamente a la atención en la fase preanalítica, posanalítica y el asesoramiento al médico y al paciente, por el simple hecho de que la fase analítica es un tema superado por la tecnología.

Al igual que en la conducción de un automóvil, un instrumento lo puede manejar cualquier persona, oprimiendo solamente un botón, pero creo que un profesional debe poder conducir las metodologías y los instrumentos de tal manera, que pueda resolver o identificar los problemas que a diario pueden existir, por la causa que fuera.

En este artículo traté, o al menos lo intenté, explicar que cualquier error, producto de una reconstitución de los calibradores, estándares o ajustadores liofilizados, con un volumen de agua incorrecto, como le sucedió a la doctora con los ajustadores de DHEA-sulfato en un sistema automatizado, o un incorrecto almacenamiento de los calibradores o estándares, como le sucedió al doctor en el caso de la prolactina por una técnica manual isotópica inmunométrica, y como me sucedió a mí, con la incorrecta elección –desfase de una dilución– de los calibradores en una técnica isotópica competitiva, todas conducen a lo mismo, a una disminución en el número de moles del analito que el anticuerpo va a reconocer y el resultado será independiente de lo que esperamos, deseamos, pretendamos o queramos obtener.

También es importante considerar que los problemas o situaciones que ocurrieron en el caso real planteado, son válidos para todas las metodologías inmunoanalíticas, enzimáticas o químicas.

Apartado. La etapa de desarrollo de las marcaciones de la T3 y la T4 con 125I, consideradas como las únicas moléculas cuya marcación era doblemente isotópica, en primer lugar porque ambas moléculas contienen Iodo en su estructura molecular y eran marcadas con un isótopo radiactivo del Iodo, y en segundo lugar, el mismo 125I radiactivo reemplazaba al 127I estable en el caso de la T3 y la incorporación de un átomo de Iodo (125I) en el caso de la T4, utilizando únicamente Triiodotironina marca Sigma (T3) para obtener T3 y Tmarcadas.

El Iodo es un elemento y componente natural de la estructura molecular de las hormonas tiroideas; por lo tanto se descarta la posibilidad de que el anticuerpo pueda reconocer en forma diferente –en la técnica radioinmunoanalítica– a las moléculas marcadas de las que no están marcadas, en las que difieren en dos unidades de masa atómica entre los dos isótopos del Iodo.

Como indiqué anteriormente, a finales de la década de 1980, utilizando una técnica propia de marcación y purificación de las hormonas tiroideas marcadas con 125I y midiendo la actividad específica por la técnica de autodesplazamiento con anticuerpos, inventada por el Dr. Eduardo H. Charreau con la aplicación para Radio Receptor Assay (RRA), una combinación de ensayos de saturación y competencias, con las representaciones gráficas de Scatchard y Michaelis Menten, pude obtener un valor muy preciso de actividad específica de las hormonas inmunológicamente activas de 3.300 mCi/mg. Para no abundar en términos radioquímicos, solo quiero significar que la radiactividad medida del trazador en el seno de la reacción correspondía a una concentración molar de varios órdenes de magnitud menores, comparada con la concentración molar del primero de los estándares para el desarrollo de los sistemas T3 Total y T4 Total en humanos.

Trabajando con las propiedades del trazador obtenido, la concentración molar de los anticuerpos, el aumento de volumen de los calibradores o estándares, QCI y muestra, que implica un incremento de masa de las hormonas tiroideas en el mismo volumen final de incubación, y teniendo la posibilidad de variar la constante de afinidad (Ka) de los anticuerpos, disminuyendo la temperatura y aumentando el tiempo de incubación, según la ecuación ΔG0 = -R T Ln Ka, tal como fue citado en el Caso Real 01, me motivó a desarrollar un sistema inmunoanalítico altamente sensible destinado a medir T3 Total y T4 Total para caninos. (Se debe tener en cuenta que del universo de las mascotas caninas o Canis familiaris, el 50% de ellas –en algún momento de su vida– cursa un hipotiroidismo con síntomas y signos clínicos de fácil solución para el médico veterinario, con la administración de una dosis de levotiroxina por kilogramo de peso).

Los valores de referencia de T3 Total y T4 Total en los perros, están en un orden de magnitud menor que en humanos. Este tema será ampliado en un próximo artículo en la sección “Oportunidades de crecimiento” correspondiente a la aplicación de la bioquímica en la medicina veterinaria.

Ver Caso Real N° 02

Autor: Dr. Eduardo E. Castellani