CASO REAL 05

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Técnicas inmunoanalíticas cualitativas. Antígeno de superficie de hepatitis “B” (HBsAg) - Segunda parte. Solución de los casos reales expuestos.

Caso 1. Un profesional bioquímico realizó el siguiente comentario: “He tenido un grave problema con el médico y con las pacientes por culpa de esta metodología y con este instrumento. He realizado las determinaciones del Antígeno de Superficie del Virus de la Hepatitis B (HBsAg) de dos pacientes embarazadas y como los resultados fueron positivos en ambos casos, los informé”. El mismo médico sugirió a las pacientes que deberían acudir a otro laboratorio, y los resultados de ambos test fueron negativos. El bioquímico me preguntó: “¿No significa que esta metodología es la más sensible de todas las existentes?”.

Causas: Errónea interpretación de los procesos analíticos. Soluciones.

En primer lugar, debemos analizar el significado de la sensibilidad, citada por el profesional.

Como explicamos en los casos prácticos 3, 4 y 6, la palabra sensibilidad es un tanto controversial y abarca un espectro muy amplio de definiciones; una de ellas, y muy importante, es la sensibilidad de calibración, y otras carecen de sustento analítico, como la sensibilidad analítica, la dosis mínima detectable o Sensitivity y, la sensibilidad funcional, entre varias. La definición a la que hacemos mención en el curso de posgrado Inmunoanálisis que dictamos en el Instituto de Biología y Medicina Experimenta (IBYME-CONICET), nos referimos al “Límite de cuantificación” y representa la concentración más baja que se puede medir, cumpliendo con la precisión y la ausencia de desvíos, establecida para el método utilizado y acorde con nuestras condiciones de trabajo.

Si bien es cierto que la automatización permitió lograr la precisión y la productividad imposibles de obtener con las técnicas manuales en lo concerniente al beneficio de la disminución del límite de detección, en técnicas inmunoanalíticas solo es transcendente y con interés clínico, aplicable a unos pocos analitos, como el PSA total, el PSA libre, la hTSH, la PCR ultra sensible, la hCG y la Tiroglobulina, entre otros. Para la gran mayoría de los analitos, esa diferencia carece de importancia y para otros, resulta imposible lograr una diferencia sustancial en la disminución del límite de detección con respecto a las técnicas manuales.

Lo que sucedía, no hace más de veinte años, con respecto a los tiempos de las entregas de los resultados a los pacientes y a los médicos, sobre analitos como la D4-Androstenediona, SO4-DHEA, etcétera, podían superar los 30 días de demora y la alta productividad de la automatización, redujo esos tiempos a pocos días.

Con la expansión del conocimiento del público en general –generado por el acceso a la información en tiempo real, la influencia de las redes sociales, el avance de la ciencia, la tecnología y el interés por mantener y mejorar la calidad de vida– el profesional médico tiene mayor requerimiento y dependencia del laboratorio clínico y ya no se diagnostica, trata, monitorea y modifica la posología, exclusivamente por las experiencias personales y la consideración a la presunción clínica como soberana.

En la actualidad, más del 90% de los resultados de varios cientos de pacientes que asisten diariamente a los grandes laboratorios clínicos privados y hospitalarios, se puede informar dentro de las 48 o 72 horas, y en muchos casos, el médico puede tener acceso a ellos en tiempo real, todo debido al avance de las comunicaciones, la informática y la automatización.

Hace más de 40 años, en la Prueba de Galli Mainini se debía esperar varios días para que un sapo macho –previa inoculación de 10 mL de orina o suero de una mujer supuestamente embarazada– se podía verificar la presencia de espermatozoides del animal en la orina, extraída con una pipeta Pasteur de la cloaca del animal, por la respuesta biológica a la presencia de la hCG en la sangre u orina de la paciente, para confirmar el embarazo.

A comienzos de la década de 1970, se comienza a utilizar las técnicas inmunoanalíticas basadas en el test de látex, una técnica más específica, rápida y con una disminución del límite de cuantificación que una respuesta biológica producida en un animal.

Luego hubo una generalización de las técnicas isotópicas, como el radioinmunoensayo (RIA), a finales de la década de 1970 y a posteriori, las técnicas inmuno-radiométricas (IRMA) con anticuerpos monoclonales a mediados de la década de 1980 –técnicas manuales poco utilizadas a la fecha– y así se lograba disminuir el límite de cuantificación, pero se debía realizar incubaciones de entre 2 y 3 horas, acorde con los diseños de los reactivos de las distintas marcas comerciales, se debía confeccionar una curva de calibración dosis-respuesta para interpolar las muestras de las pacientes para informar la existencia del embarazo o el valor de la hCG en forma cuantitativa.

Es importante destacar también los numerosos y primitivos ensayos de RIA manuales de otros analitos que requerían incubaciones de más de 24 horas en heladera a una temperatura de 4 a 8 °C; también hasta hace poco tiempo, el ensayo de la insulina por RIA, requería incubaciones over-night a temperatura ambiente. Todos esos tiempos y temperaturas de incubación estaban vinculados con llegar al estado del equilibrio de la reacción Ag-Ac, para lograr el límite de detección esperado, acorde con los indicados por los fabricantes de reactivos y las necesidades clínicas.

Los diferentes ensayos manuales no isotópicos –EIA y ELISA– también requieren tiempos y temperaturas de incubación acorde con el diseño y las requisitorias del fabricante para llegar al equilibrio Ag-Ac y obtener los límites de cuantificación esperados. Es lo que ocurre en general y es independiente del analito de que se trate.

Con lo expuesto, quiero significar la importancia para obtener la mejor precisión y el límite de cuantificación posible en una técnica manual y, probablemente, muy pocos reactivos –o solo alguno de ellos– podían coincidir en los tiempos y las temperaturas de incubación.

Qué sucede hoy, ¿la automatización, la ciencia y la tecnología de la “robotización” han podido modificar las leyes de la física y los valores de las constantes de equilibrio de los anticuerpos?, cuando pueden reducir los tiempos de incubación a niveles de entre 15 y 60 minutos para obtener el resultado de concentración, según sean las metodologías inmunoanalíticas automatizadas, marcas comerciales o modelos de instrumentos.

Definitivamente no, la automatización permite operar con excelente precisión en condiciones de pre equilibrio en una, o a lo sumo dos, condiciones sus tiempos de incubación, situaciones que no eran posibles, al menos en la mayoría de las técnicas manuales.

Además también, distintas metodologías, marcas comerciales y modelos de instrumentos operan las reacciones a distintas temperaturas, algunas de ellas a 37 °C y otras, a temperatura ambiental (TA).

Hay que tener presente que en los instrumentos que operan las reacciones a TA se indica en los manuales de instrucción del fabricante, un rango de temperaturas propuestas pero, la temperatura del laboratorio deberá permanecer constante y en muchos casos, la indicada estará comprendida entre 23 y 25 °C.

En conclusiones, podemos decir que en los últimos 40 a 50 años, en la evolución de las técnicas inmunoanalíticas, pasamos desde la artesanía y el protagonismo del profesional bioquímico al inyectar un sapo macho, a procesar todo tipo de técnicas manuales y, en la actualidad, solo colocar los reactivos y las muestras de los pacientes en un instrumento, oprimir un botón y esperar un breve tiempo hasta obtener los resultados.

A diferencia del pensamiento de varios colegas que sostienen que el bioquímico ha perdido protagonismo en el desarrollo de actividad analítica de otrora en su laboratorio, personalmente sostengo todo lo contrario, como lo he citado en otros casos prácticos.

Tal como fue explicado, hemos pasado de incubar las reacciones a temperaturas y tiempos de los más variados para llegar al equilibrio Ag-Ac, a tener una, o a lo sumo, 2 tiempos de incubaciones diferentes en los sistema automatizados, con una única temperatura de incubación.

La biotecnología aportó innumerables ventajas en la calidad y la producción de los anticuerpos específicos, una alta calidad de los antígenos para ser utilizados en las curvas de calibración, ajustadores y controles y, además, lograr una muy buena estabilidad de todos los componentes del sistema inmunoanalítico en general.

En décadas pasadas se produjeron cambios en los informes de los controles de calidad externos; los datos informados por los laboratorios presentaban una gran dispersión pero, debido a la automatización, los laboratorios pasaron a obtener datos con alta precisión, pero con importantes desvíos entre las distintas metodologías, marcas comerciales e inclusive, distintos modelos de instrumentos que utilizan la misma metodología, y además, utilizando el mismo reactivo en diferentes instrumentos de la misma marca comercial, con diferente nivel de productividad o velocidad de procesamiento.

Resulta interesante destacar que se observan pequeños desvíos entre instrumentos y lotes de reactivos iguales, pero ello se debe a problemas intrínsecos de los instrumentos (tema que será explicado en otro caso práctico), sin que se observen imprecisiones.

Debemos considerar además, que las reacciones ocurren a presión constante y a la temperatura ambiente o regulada a 37 °C y, al ser calificados como sistemas termodinámicos abiertos, instrumentos que operan a distintas temperaturas ambientales y ubicados a diferentes alturas sobre el nivel del mar, puede obtenerse valores, para una misma muestra o control de calidad, que podrán diferir el valor de concentración, a pesar de mantener una excelente precisión en sus repeticiones.

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Es importante también tener en cuenta que el desarrollo de sistemas de respuestas altamente amplificadas, como la quimioluminiscencia y la electroquimioluminiscencia, permitió mejorar considerablemente la estadística de la medición de la respuesta y así poder obtener –en un mismo rango de concentraciones en las técnicas manuales– valores de concentración muy precisos, con un bajo nivel del límite de cuantificación en condiciones críticas de pre equilibrios.

En técnicas isotópicas, como RIA o IRMA, las respuestas se producen por la emisión de un número determinado de fotones gamma, interactúan con compuestos como en un cristal sólido de ioduro de sodio y por el fenómeno de centelleo, los fotones gamma se transforman en fotones del espectro visible; estos fotones son amplificados por el fotomultiplicador y darán origen a impulsos o pulsos cuya cantidad será proporcional a la cantidad de fotones gamma incidentes, originados por la respuesta de los diferentes tubos, correspondiente a los calibradores, controles de calidad y muestras. La emisión de los fotones gamma son eventos independientes.

Los eventos lumínicos o fotones del espectro visible emitidos en las respuestas de las técnicas de quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia, también son fenómenos o eventos individuales, es decir, un fotón existe o no y, en consecuencia, son variables aleatorias discretas que toman valores enteros y no negativos y se distribuyen acordes con la distribución de Poisson. La distribución es diferente de las respuestas de densidad óptica (DO), que se distribuyen normalmente acorde con la distribución de Gauss, dado que pueden obtenerse infinitos valores entre una unidad y otra.

La característica de las variables que se distribuyen según la distribución de Poisson es que un valor obtenido es un estimador de la media muestral y a su vez, es igual a la varianza de ese dato de respuesta; para dar un ejemplo, un valor de respuesta de 1.000.000 unidades lumínicas o como el fabricante las denomine, es un estimador de la media y le corresponderá un valor de ES de 10.000 unidades lumínicas (dado que el ES representa la raíz cuadrada de la varianza).

Si el valor de concentración de un analito cualquiera, que surgió de la interpolación de la respuesta en una curva dosis-respuesta, corresponde a 1.000.000 de unidades lumínicas, el valor de la respuesta estará –con una aproximación del 95% de confianza– comprendido entre 980.000 y 1.020.000 unidades lumínicas y por consiguiente, los valores de concentraciones que corresponden a ese intervalo no serán estadísticamente diferentes.

¿Que sucedió en el caso N° 1?, el profesional bioquímico obtuvo una respuesta que el instrumento indicó que la muestra era reactiva (en ese momento indicaba la palabra positive) cuando en realidad correspondía a un falso positivo.

En un sistema inmunoanalítico, particularmente, considero que el análisis de las respuestas es más importante que el valor de concentración obtenido para una técnica cuantitativa, o que el informe positivo o negativo, en el caso de las técnicas cualitativas.

Cuando le pregunté el valor de las respuestas de los calibradores o ajustadores (Cut-off), de los controles de calidad y de las muestras, el profesional me comentó que no procesó los controles de calidad correspondientes porque lo consideró innecesario, por ser un reactivo nuevo y recién ajustado.

Entonces, le solicité los valores de las respuestas del único calibrador o ajustador, que representa el Cut-off y los valores de las respuestas de las muestras informadas como HBsAg positivas y, la respuesta del promedio del Cut-off fue de 50.000 cps y las muestras, realizadas por simple y única determinación, sus valores resultaron de 50.100 cps y 50.200 cps para las respectivas muestras de las pacientes.

Con estos datos de respuestas y considerando, en la medición del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), no se indican zonas indeterminadas o grises, si se realizan los cálculos matemáticos mencionados, se puede concluir que el valor de la respuesta del calibrador o ajustador, correspondiente al Cut-off, no difería estadísticamente de las respuestas originadas de las reacciones inmunoanalíticas de los pacientes, con un 95% de confianza.

Debemos considerar que los resultados son obtenidos por una computadora y como tal, es un componente de un sistema inmunoanalítico automatizado que no tiene, ni debe tener, capacidad para pensar y para hacerlo está el profesional bioquímico para decidir la toma de decisiones.

Repetir la muestra en el mismo momento tampoco era una solución viable, dado que el instrumento podía informar aleatoriamente, un resultado positivo como negativo.

Este caso puntual se debió a un valor obtenido que fácilmente podía explicarse por las variaciones estadísticas propias de la distribución de Poisson.

También podemos obtener altos valores de respuestas, que indicarían índices de positividad de HBsAg mucho mayores y por ello, se deberá tener en cuenta las alteraciones inmunológicas que ocurren en el organismo de una mujer en el estado de reciente embarazo, donde no solo podemos obtener resultados positivos o reactivos –según el informe emitido por el instrumento– sino también valores positivos o reactivos de VIH e HCV, cuando todos estos valores resultan, mayoritariamente correspondientes a falsos positivos.

Todos los bioquímicos, trabajadores en relación de dependencia o propietarios de pequeños, medianos o grandes laboratorios tienen iguales posibilidades para el crecimiento y posicionamiento profesional, intelectual y económico.

Caso 2. Situación planteada en el caso práctico anterior: “Una paciente que asistía asiduamente a mi laboratorio, a cinco meses de haberle realizado el primer control bioquímico de su embarazo, pasó por el laboratorio para insultarme. El resultado del HBsAg fue informado positivo y le provocó grandes inconvenientes. El médico le indicó que debía viajar a Buenos Aires (60 km de su domicilio) para confirmar los resultados de una posible infección de hepatitis 'B'. Luego de la realización de diferentes pruebas en otro laboratorio, el resultado determinó que la mujer no estaba infectada con hepatitis "B".

Mi amigo me comentó, que esa prueba no la realizaba en su laboratorio y que derivaba la muestra a un laboratorio muy prestigioso en Buenos Aires; además, poseía el informe firmado por el director técnico de ese laboratorio que certificaba que la muestra era positiva para HBsAg.

Desde hace muchos años, resulta imposible realizar la totalidad de las prácticas bioquímicas disponibles –independientemente del tamaño– en el propio laboratorio pero, para las prácticas que realice y tercerice a los laboratorios de mayor complejidad, además de contar con los conocimientos de la fisiología y la fisiopatología, obtenidos cursos de posgrado, congresos, etcétera, vinculados a las diferentes especialidades y maestrías, el profesional bioquímico deberá poseer los conceptos claros y el total dominio de las fases analíticas, para tener sus propios sistemas bajo su control o, ante el surgimiento de dudas, para controlar a los laboratorios en los que confían los activos, o sea, los propios pacientes de sus laboratorios.

La utilización de las herramientas que fueron descriptas en el último punto del caso práctico N° 7, el  profesional bioquímico hubiese evitado los inconvenientes a la paciente y al médico, que dio origen a la situación N° 2. Es importante recordar que, la satisfacción del paciente, impulsa a la lealtad de continuar asistiendo al laboratorio y provoca un efecto multiplicador, con las personas que éstos tienen contacto o viceversa.

IMPORTANTE: vuelvo a reiterar, como lo hice en casos prácticos anteriores, la calibración de un analito representa la ruta por donde circulamos, el control de calidad nos da el lugar preciso de la ruta en donde estamos ubicados geográficamente, para ilustrar con un ejemplo.

En el próximo caso práctico continuaremos con el mismo tema, con nuevos casos reales, con el análisis de los tipos de las respuestas de los distintos sistemas inmunoanalíticos y las sugerencias para la utilización de los demás marcadores de la hepatitis B.

Autores: Dr. Eduardo E. Castellani, con la colaboración del Dr. Marcelo D. García

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