FACTORES QUE AFECTAN LA SENSIBILIDAD DE LOS INMUNOENSAYOS - PRIMERA PARTE

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Primera parte: factores que efectan la sensibilidad de los inmunoensayos

“La única verdad absoluta es que no hay verdades absolutas”

Dr. Paul Feyeraben - Científico y filósofo austríaco (1924 - 1994)

Es la frase referencial del vídeo "Método Científico y Pensamiento Crítico" - Ver vídeo

Los conceptos que volcaremos en los próximos casos prácticos surgen de experiencias en desarrollo de técnicas inmunoanalíticas, de observación y análisis de problemas intrínsecos metodológicos y operacionales de más mil profesionales con los que he compartido experiencias, usuarios de diferentes técnicas y metodologías, y del análisis de leyes física y fisicoquímica que rigen los sistemas inmunoanalíticos [Ag-Ac], que involucran componentes marcados o conjugados.

No pretendemos que ello se interprete como clases de Física, Fisicoquímica, Química biológica, Inmunología, Bioestadística, etcétera, porque solo estaríamos uniendo los puntos del sistema inmunoanalítico para poder comprender que sucede dentro de un tubo, un pocillo de microplaca o una celda de reacción, y con ello solucionar problemas al alcance del profesional en su laboratorio.

La explicación de las experiencias está abordada con fines solamente didácticos, para la exclusiva comprensión de la interacción Ag-Ab dentro del contexto metodológico en el ejercicio profesional, para  orientar la búsqueda e identificar las limitaciones propias de esas técnicas, con la finalidad de poder diferenciar los errores o problemas operativos en los diferentes sistemas inmunoanalíticos, manuales y automatizados. Las explicaciones y la obtención de soluciones a los problemas mencionados, son extrapolables a las diferentes técnicas basadas en el fundamento antígeno-anticuerpo.

Nos basta con realizar una revisión de toda la bibliografía existente sobre los inmunodiagnósticos, inmunoensayos u otras técnicas bioanalíticas, y observaremos que diferentes autores definen la sensibilidad o el valor mínimo medible de un analito de varias maneras.

La realidad es que la sensibilidad es dependiente del tipo de sistema y su correspondiente señal de medición, de la constante de equilibrio o afinidad (Ka) del anticuerpo empleado, de la actividad específica (cantidad y capacidad de generación de respuesta de una determinada señal por unidad de masa del analito o anticuerpo marcado o conjugado), según sea un sistema inmunoanalítico competitivo o un sistema inmunométrico y, además, la sensibilidad está asociada al error producido entre los replicados.

El grado del error entre los duplicados o el CV obtenido, incluidos también los desvíos entre las diferentes técnicas, metodologías y marcas comerciales, se deben a:  

  1. Factores intrínsecos, como la distribución estadística a la que pertenece el tipo de respuesta. (densidad óptica, radiactividad, fluorescencia, eventos de fotones provenientes de la bioluminiscencia, quimioluminiscencia y electroquimioluminiscencia). Eficiencia de medición de la respuesta.
  2. Factores intrínsecos propios de los diferentes sistemas inmunoanalíticos.
  3. Propiedades físicas, como el manejo de líquidos por el tipo y el estado de la micropipeta en técnicas manuales, el tamaño de los volúmenes, sea una técnica manual o automatizada.
  4. Leyes de la física y la fisicoquímica que rigen el sistema inmunoanalítico.
  5. Si corresponde a un sistema competitivo de un paso, competitivo secuencial o sistema no-competitivo, también llamado inmunométrico o sándwich.
  6. La eficiencia del sistema de separación.
  7. El grado de miniaturización de las técnicas.
  8. El rango de la curva de calibración.
  9. La concentración molar de cada componente en el seno de la reacción.

Para comenzar a describir los factores que afectan la sensibilidad de los sistemas inmunoanalíticos heterogéneos cuantitativos, empezaremos con el análisis del punto 1. 

 La potencia del anticuerpo. La constante de equilibrio (Ka) del anticuerpo o Ka intrínseca promedio en el caso de los anticuerpos policlonales y la concentración de las inmunoglobulinas

 El anticuerpo es la vedette en todos los sistemas inmunoanalíticos; deberá ser altamente específico a la molécula que va a cuantificar o identificar y se obtiene por inmunización provocada en diferentes especies animales o, por diferentes técnicas, en el caso de anticuerpos monoclonales.

Muchos autores sostienen que la sensibilidad de los sistemas inmunoanalíticos depende de la constante de afinidad del anticuerpo; en realidad también depende de la actividad específica del componente marcado (cantidad y capacidad de generación de respuesta de una determinada señal por unidad de masa del analito o anticuerpo marcado o conjugado), del tipo de sistema y su correspondiente señal de medición, según sea un sistema inmunoanalítico competitivo (SIC) o un sistema inmunométrico (SIM) y, además, está asociada, por diversos factores, al error producido entre los replicados de la misma muestra.

Los anticuerpos, (el más utilizado en técnicas inmunoanalíticas es la IgG), es una glicoproteína con PM de aproximadamente 150.000 daltons, compuesta por dos dobles cadenas (Gráfico 1). Cada mitad de la inmunoglobulina está compuesta por una cadena pesada (g) y una cadena liviana (k o l) y ambas mitades están unidas por puentes disulfuros. La molécula completa se divide en una zona con actividad biológica y otra, con actividad inmunológica. 

 

La zona de la inmunoglobulina llamada región variable; es flexible y es la que tiene posibilidades de plegarse o alterarse para reconocer y unir de forma reversible el epitope de su antígeno específico. Cabe destacar que el antígeno deberá también tener una determinada flexibilidad (Gráfico 2) para la unión Ab-Ag. Ambos representan una unión o encaje semejante al de una máscara-cara.

Los animales de cualquier especie pueden producir millones de moléculas de anticuerpos diferentes y cada uno con un sitio diferente de unión y correspondiente al antígeno que lo originó (Gráfico 3). Cada anticuerpo reconoce su antígeno con alta especificidad.

 La unión antígeno-anticuerpo es una reacción reversible y el sistema inmunoanalítico competitivo (SIC) se explicó –hace más de 50 años– sobre la base de la “Ley de Acción de Masas”. También fueron explicadas por la misma ley las reacciones enzima-sustrato, la unión ligando-receptor, proteína-proteína ligadora, entre otras reacciones; sus diferencias entre todas son los productos finales obtenidos.

    Los anticuerpos específicos utilizados en los SIC generalmente son policlonales y las familias de inmunoglobulinas que los componen están dirigidas contra uno o más epitopes del analito presente en los estándares o calibradores, los controles de calidad, las muestras y el trazador.

La potencia del suero inmune obtenido, resultará de la combinación de la constante de equilibrio o afinidad (Keq o Ka) de las inmunoglobulinas y su concentración molar. 

En el caso de que el antígeno (inmunógeno) con el que se obtuvieron los anticuerpos tenga múltiples epitopes, se obtendrán varias familias de inmunoglobulinas contra ese antígeno y tendrán una constante de equilibrio o afinidad intrínseca promedio y representan una medida de la fuerza de los anticuerpos.

En los sistemas competitivos el trazador es la misma molécula que se analiza o cuantifica, pero con una marca o etiqueta (núcleos radiactivos, enzimas, biotina, elementos lantánidos, complejo de rutenio, etcétera) en concentraciones molares de trazas o vestigios, estará constante en todos los tubos de reacción y competirá con el analito presente en los estándares, los controles de calidad o en las muestras, por los sitios específicos de unión provenientes de una concentración molar limitada de anticuerpos, que también será constante en todos los tubos.

El trazador [Ag*] es denominado conjugado cuando tiene ligado una enzima (también se denomina conjugado a otra molécula que interviene indirectamente en el sistema inmunoanalítico y tiene unida una enzima u otro marcador, pero al no intervenir en forma directa en la inmunorreacción primaria, no estará en concentraciones molares de trazas). El nombre trazador es histórico, no se debe considerar como sinónimo de trazador radiactivo. La concentración molar o el deterioro del trazador, podrá ser otro causante que afecte la sensibilidad de los inmunoensayos y será explicado en otro caso práctico.

Después de que la reacción llega al equilibrio, en tiempo y temperatura de incubación debidamente estudiados para un determinado analito con su correspondiente anticuerpo específico, y completa el SIC, un sistema de separación de los complejos altamente eficiente sin alterar el equilibrio.

El sistema de separación será el responsable de separar los complejos [Ag*-Ac] y [Ag-Ac] (productos de la inmunorreacción primaria) de las fracciones de hormonas libres o no unidas [Ag*] y [Ag] en el seno del tubo de reacción, y así poder obtener una respuesta o señal medible, emitida o generada en forma directa o indirecta, exclusivamente por los complejos. 

La cantidad de la señal emitida por los complejos marcados en los SIC será, inversamente proporcional a la concentración del analito u hormona presente en los estándares, controles o muestras proveniente de los distintos tubos de reacción o unidades de ensayo.

En el esquema de la ecuación de equilibrio (Gráfico 4) y en la representación gráfica de la curva dosis-respuesta (Gráfico 5), se puede observar que a mayor concentración molar del analito [Ag], la concentración del trazador libre [Ag*] aumentará, y será eliminada por el sistema de separación de los inmuno-complejos; la señal o respuesta proveniente del complejo [Ag*-Ac] disminuye a expensas del aumento de la concentración molar del complejo [Ag-Ac] que no tiene marca.

   

Gráfico 4 - Esquema de ecuaciones y equilibrio del sistema inmunoanalítico competitivo

 

Gráfico 5 - Curva D-R sistema inmunoanalítico competitivo

Los complejos que resultan de la inmunorreacción primaria, al encontrarse en concentraciones del orden de pico-molar o femto-molar, no son precipitantes por centrifugación. Los diferentes sistemas de separación se explicarán en otro caso práctico debido a que también ejercen una real influencia en la sensibilidad de los inmunoanálisis, dado que la tecnología ha logrado resultados altamente eficientes en la separación de la fracción unida (B) de la libre (F).

Los sistemas inmunoanalíticos competitivos (SIC) han quedado vigentes solo para los analitos tipo haptenos, como las hormonas esteroides, tiroides, metabolitos de drogas de abuso, drogas terapéuticas, etcétera; también para proteínas de muy baja frecuencia o demanda de ensayos en nivel mundial o para ciertos analitos que las empresas de diagnóstico no han considerado conveniente desarrollarlos en sistemas inmunométricos.

Por supuesto que la técnica competitiva e isotópica como el RIA sigue siendo de gran utilidad para analitos muy específicos y nuevos desarrollos. Es clave en investigación básica y aplicada para nuevas moléculas y sigue siendo la metodología Gold Standard por ser simple, rápida, económica y fácil de optimizar y estandarizar.

Para el desarrollo de una nueva técnica se requiere la proteína o molécula purificada que se quiera cuantificar o identificar. Una cantidad de ella se utilizará para inmunizar animales a fin de obtener anticuerpos específicos (los diferentes tipos de inmunización dependerán de las características de la molécula), otra cantidad se destinará para preparar la serie de calibradores o estándares de concentraciones conocidas y, por último, una cantidad de ella para ser marcada acorde con el tipo de molécula, y muy fácilmente con iodo radiactivo (125I). Este diseño se completa con un sistema de separación que consta de un anticuerpo obtenido en otra especie animal, dirigido contra la fracción Fc del anticuerpo específico de la especie animal de la que se obtuvo el primer anticuerpo.

Ese anticuerpo, también denominado segundo anticuerpo, se optimiza junto con una determinada concentración de PEG (Polietilenglicol) disuelto en buffer con pH y FI apropiada. El PEG tiene las propiedades de desolvatar proteínas y así, favorecer la formación de una red y poder precipitar los complejos por centrifugación sin alterar el equilibrio.

Así de fácil y simple, pero probablemente la ciencia, el interés del analito para el diagnóstico, la factibilidad de poder ser automatizado, la demanda mundial y las áreas de I & D de la industria del diagnóstico, harán que ese sistema que nació por RIA en un laboratorio de investigación y desarrollo nunca se comercialice como tal, y se transforme en un reactivo automatizado por alguna metodología y marca comercial, desarrollado en algún esquema de EIA, miniaturizado en técnicas de biosensores o de flujo lateral, en inmuno-array por nanotecnología, etcétera, acorde con la sensibilidad requerida, a la urgencia de la disponibilidad de los resultados, al número de tests demandados por el laboratorio y, por supuesto, al precio que el mercado, por su interés, lo pueda o lo quiera pagar.

Como hemos mencionado, el fundamento del SIC fue explicado por medio de la “Ley de Acción de Masas”. Esta Ley fue postulada en su enunciado original por datos experimentales por los científicos noruegos Cato M. Guldberg y Peter Waage en 1870; los autores la definieron como “Fuerzas de Acción” y “Masas Activas”.

Para un sistema químico en equilibrio, el principio de Le Châtelier* permitía establecer de qué manera se desplazaba el equilibrio por el cambio de concentraciones o temperatura, pero no en qué medida. El enunciado de los principios de la Ley de Guldberg y Waage permitió realizar una descripción cuantitativa de la reacción de equilibrio.

Para una reacción genérica: aA + bB <-> cC + dD 

 

a, b, c y d son los coeficientes estequiométricos que se obtienen para ajustar la ecuación. De la relación entre las concentraciones molares de los productos y los reactivos se obtiene la constante de equilibrio Keq, que solo depende de la temperatura.

La teoría del enunciado de la Ley de Guldberg y Waage recién pudo ser explicada años después por medio de las leyes de la termodinámica.

Modelo planteado para el sistema inmunoanalíticos competitivos:

cuando la reacción llega al equilibrio, se igualan las velocidades de formación y disociación del complejo [Ag*-Ac].

En magnitud, la constante de velocidad de formación del inmuno-complejo (k1) deberá ser mucho mayor que su constante de velocidad de disociación (k-1) para que la reacción de formación del complejo se produzca espontáneamente:

De la relación entre ambas constantes y previo pasaje por un estado de transición, surge la constante de equilibrio o afinidad (Keq o Ka) que es la resultante de la relación de los productos y los reactivos; es igual a la Ka del anticuerpo y es dependiente de la temperatura:

Otra forma de expresión es como una función de velocidad:

Cuando se llega al equilibrio:

Algunos autores describen la constante de disociación (Kd), como la inversa de [Ac]libre y otros, como la inversa de [Ag*]libre cuando la concentración molar del antígeno en el medio de la reacción, es del 50% del total agregado.

Con fines teóricos, para aceptar el modelo matemático planteado para la cinética del SIC, se requiere hacer un número importante de ensayos y consideraciones que en la práctica resultan poco factibles, pero conocerlas nos podrá ayudar a diferenciar las limitaciones intrínsecas de los inmunoanálisis de errores operativos que ocurrieren en el ejercicio profesional en la práctica diaria.

Consideraciones:

  • El Ag deberá ser homogéneo, es decir, pertenecer a una misma especie química.
  • El Ac deberá ser también homogéneo.
  • El Ag deberá tener un solo epitope para unirse al Ac.
  • El Ac deberá tener un solo sitio de unión que reconocerá el epitope del Ag, y con la misma afinidad.
  • La reacción deberá llegar al equilibrio.
  • La separación de la fracción libre de la unida deberá ser del 100%.
  • No deberá haber unión inespecífica (Ej.: a la pared de los tubos o los pocillos).
  • Los sitios de unión [Ac] deberán ser idénticos y no interactuantes (No deberá existir efectos cooperativos, Ka=Ki).
  • La concentración del anticuerpo específico deberá ser constante en todos los tubos y en teoría limitante para permitir la competencia entre Ag* y Ag, aunque realmente estará en una determinada concentración molar [Q], alrededor de +/- un orden de magnitud de la Kd (constante de disociación del anticuerpo), donde Kd=1/Ka; es decir, la ventana sensible de los sistemas inmunoanalíticos competitivos (VS-IAC).
  • La concentración molar del Ag* deberá ser constante en todos los tubos y su comportamiento frente al anticuerpo deberá ser igual al Ag.
  • La reacción deberá llegar al equilibrio. (Existen en la práctica ensayos que no llegan al equilibrio; en esos casos los tiempos y la temperatura de incubación son críticos).
  • En ausencia de Ag sin marcar, la [Ac] deberá ser tal que en equilibrio, la [Ag*] libre (F) deberá ser igual a la [Ag*] en el complejo (B). La ventana sensible óptima del IAC comienza cuando la respuesta de F y B es del 50% del agregado total de Ag*, tal que T = B + F.
  • La separación de B y F deberá ser 100% eficiente y no deberá alterar el equilibrio. (Los sistemas de separación en fase sólida son los más eficientes).
  • Los estándares de la curva de calibración deberán estar en una matriz similar al suero humano y tener igual comportamiento que el analito que se va a medir. (condición necesaria).
  • La serie de estándares o calibradores (Ag) deberán ser de concentración conocida. (Todos los IA son referenciados a una curva de calibración).
  •  La concentración molar del trazador o conjugado [Ag*] deberá estar en concentración de trazas, es decir que la [Ag*] debe tender a 0.

Ensayos que se realizan en laboratorios de investigación y desarrollo:

  • Titulación del anticuerpo.
  • Máxima capacidad de unión del antígeno por su anticuerpo específico.
  • Cálculo de Ka del anticuerpo por diálisis o para estar en situaciones semejante a los ensayos de competencia, las técnicas de Scatchard para el cálculo de Kao de Saturación (Michaelis-Menten) para el cálculo de Kd.
  • Cálculos de la actividad específica del antígeno (Ag) inmunológicamente activa con múltiples ensayos de saturación y competencia.
  • Desarrollo de las técnicas en el rango de interés clínico.
  • Evaluación de las reacciones cruzadas.
  • Optimización y estandarización de las diferentes técnicas.

Quisiera comentarles son muy pocos los ítems que pueden cumplir las consideraciones descriptas en los ensayos de la práctica diaria e igualmente se ajustan al modelo propuesto:

  • Salvo pocas excepciones, no existen antígenos homogéneos.
  • No existen anticuerpos homogéneos; está citado en muchos libros y publicaciones que no existe la especificidad absoluta, incluidos los anticuerpos monoclonales.
  • Es imposible que el Ac reconozca de la misma forma al Ag como al Ag*, con excepción de los ensayos de RIA de T3 y T4, hormonas en cuya estructura molecular tiene iodo estable (127I) y las hormonas marcadas T3 y T4 tienen reemplazados el iodo constituyente natural por un átomo de iodo radiactivo (125I), como la vitamina B12, en cuya estructura está presente el cobalto natural (59Co) y la hormona marcada lo tiene sustituido por un átomo de cobalto radiactivo (57Co). En estos casos excepcionales, un anticuerpo no puede detectar como diferentes, dos moléculas iguales que tienen dos unidades de masa atómica de diferencia, pero las hormonas marcadas con enzimas, con iodo radiactivo donde este elemento no es constitutivo de la molécula, etcétera, hará que no se cumplan las leyes, tal como fueran planteadas.
  • En condiciones ideales, la concentración de inmunoglobulinas debe ser limitante y llegar al equilibrio; luego de la separación del complejo [Ag-Ac] la concentración de la hormona marcada debe ser del 50% del total agregado. Considerar que además estaba en concentración de trazas o vestigios.
  • En teoría, el sistema inmunoanalítico competitivo puede resolver concentraciones en un rango de alrededor de un orden de la Kd y el valor en concentración de esa constante en el mejor estimador de la D50, valor que podrá diferir –y de hecho lo hace– de una metodología a otra. Esto también podrá ser explicado sobre la base de las leyes de la termodinámica y en las condiciones del equilibrio.
  • Variaciones involuntarias provocadas -volumen agregado de los reactivos, etcétera- por el operador en el laboratorio.
  • Variaciones de la temperatura ambiente en los distintos períodos estacionales, como también los efectos que ejercen los movimientos del aire calefaccionado o refrigerado sobre la reacción inmunoanalítica o sobre los calibradores, controles y muestras, la temperatura de los baños de incubación, el almacenamiento o acondicionamiento de los reactivos.
  • El intercambio de reactivos de distintos lotes o entre distintas marcas comerciales, no tener el control sobre la calidad del agua para la reconstitución de los reactivos y calibradores que hagan que tengamos incrementados los errores analíticos con sus correspondientes variaciones entre ensayos o entre laboratorios.
  •  La falta de cuidado en la reconstitución y el almacenamiento de los controles de calidad hará que se observen alteraciones inexistentes de cualquier sistema.

Acorde con la ecuación y los ensayos de Scatchard, es posible calcular o estimar la Ka de los anticuerpos a una temperatura dada; servirá para evaluar diferentes sueros inmunes, solo para elegir los obtenidos de distintos animales para ser utilizados en nuestro sistema desarrollado, que tengan una alta concentración de anticuerpos y la mejor Ka, aunque esta no va poder ser considerada como tal en el ensayo inmunoanalítico ya que -al igual que en una ensayo enzima-sustrato en presencia de un inhibidor competitivo- en este caso por variaciones de [Ag], la Km o Kd aparente, variará su magnitud en cada tubo de reacción.

En teoría, podemos decir que el significado físico de Ka, con sus unidades L/mol obtenida por los ensayos de Scatchard es, “La cantidad de litros en que puede estar disuelto un mol de anticuerpo que unirá, en el equilibrio, el 50% de su antígeno específico, cuando este está presente en trazas”

Por transformaciones de las ecuaciones de Scatchard, podemos también estimar la Kd realizando ensayos de saturación, representando [Ag*-Ac] = f [Ag*], donde el valor de concentración [Ag*] que corresponde al 50% de la concentración máxima del complejo [Ag*Ac] es el valor de la Kd, en concentraciones molares. Deducción semejante a la ecuación de Michaelis-Menten.

Pero en realidad, dentro de cada tubo de reacción participan concentraciones molares constantes de [Ac] y [Ag*]. Existe un componente de concentración variable, la hormona [Ag], que actuará de forma similar a un inhibidor competitivo, por lo que la ecuación general que rigen los sistemas inmunoanalíticos competitivos será una transformación matemática de la ecuación de Scatchard, denominada “Ecuación de Ekins” que involucra a todos los componentes en cada tubo de reacción.

Ecuación de Ekins

Cuya resolución responde a la siguiente ecuación:

De esa ecuación cuadrática se obtiene una sola resolución posible, la que adopta los valores de B/F o [Ag*-Ac] / [Ag*] positivos.

Cuando representamos B/F = f [Ag] obtendremos una curva de decaimiento hiperbólico, típica de los sistemas inmunoanalíticos competitivos, como se puede observar en el gráfico, donde los extremos de menores imprecisiones estarán en respuestas comprendidas entre el 90% y 10% de B/F. (Nótese que las concentraciones del analito [Ag] están indicadas en unidades de masa ug/dL como en el siguente gráfico de un ensayo de Tiroxina; pero es importante saber que el anticuerpo resuelve o detecta concentraciones molares.

De esa representación surgen los parámetros Bmax, NSB, pendiente y la D50, que es el mejor estimador de la Kd cuyo anticuerpo podrá resolver concentraciones en 0,1 Kd y 10 Kd, (Son dos órdenes de magnitud que sólo fueron superados con los tres órdenes de magnitud que resuelven los sistemas inmunométricos).

Los sistemas inmunométricos (SIM), no competitivos o sándwich, están formados por dos anticuerpos que capturan el antígeno –proteína, marcador oncológico, antígeno o anticuerpo viral, etcétera– y las concentraciones molares de ambos se hallan en exceso; uno de ellos está marcado con una enzima, átomos radiactivos, complejos de rutenio, etcétera; el otro anticuerpo está fijado a fases sólidas como tubos, pocillos o perlas plásticas, o partículas magnéticas y completan los sistemas una serie de calibradores del analito de concentraciones conocidas.

Este diseño permitió aumentar -entre diez y cien veces- el nivel de detección de la molécula que se va a cuantificar y, además, al agregar la marca sobre uno de los anticuerpos, se logró mayor estabilidad del compuesto marcado. Los anticuerpos tienen un importante número de sitios reactivos en la fracción Fc, donde se incorporan las marcas, que están fuera del sitio en el que une al antígeno. Muy diferente es el caso del daño que se ocasiona –en el proceso oxidativo– en la marcación de una molécula proteica que debe ser reconocida específicamente por el anticuerpo en el sistema inmunoanalítico competitivo.

Los SIM están desarrollados para cuantificar proteínas, de las que se pueden obtener al menos dos anticuerpos dirigidos a distintos sitios de la molécula; por ello es diferente lo que sucede en la obtención de anticuerpos dirigidos contra haptenos, aunque en la actualidad, distintos grupos de investigación están desarrollando SIM para moléculas esteroides, así, en poco tiempo se podrá lograr el aumento de las sensibilidad en la medición de esas moléculas.

En los SIM, las fuerzas que operan entre el antígeno y los dos anticuerpos son las mismas que el los SIC; la diferencia radica en que la unión producida entre la molécula y ambos anticuerpos es irreversible y se asemeja a una unión covalente debido a que la constante de equilibrio (Keq) es la resultante de los múltiples equilibrios entre los complejos formados.

 

Gráfico 6 - Esquema de equilibrios del sistema inmunométrico o no competitivo

La intensidad de la señal emitida por los complejos marcados en los SIM será directamente proporcional a la concentración del analito u hormona presente en los estándares, controles o muestras provenientes de los distintos tubos de reacción o unidades de ensayo.

Gráfico 7 - Curva D-R sistema inmunométrico o no competitivo

En el esquema de la ecuación de equilibrio (Gráfico 6) y en la representación gráfica de la curva dosis-respuesta (Gráfico 7) correspondientes a los sistemas inmunométricos, se puede observar que a mayor concentración molar del analito [Ag] presente en los calibradores, controles de calidad o muestras, aumenta la concentración del complejo unido [Ac1-Ag-Ac2*] y la señal o respuesta proveniente del complejo unido a la fase sólida.

En el caso práctico 11 se realizará el análisis termodinámico de la unión Ag-Ac y ello permitirá comprender el efecto de las imprecisiones y los desvíos que ocurren habitualmente entre todas las metodologías y el profesional podrá mejorar operativamente la labor e interpretación de los resultados en el laboratorio o poder controlarlos cuando se tercerizan las determinaciones.

Autor: Dr. Eduardo E. Castellani