FACTORES QUE AFECTAN LA SENSIBILIDAD - SEGUNDA PARTE

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FACTORES QUE AFECTAN LA SENSIBILIDAD - Segunda parte

De acuerdo con lo expuesto en el caso práctico 8, se pueden observar varias situaciones que no se adaptan a los requisitos pretendidos y, en consecuencia, se percibe la necesidad de resolver algunos planteos o interrogantes:

  1. En un sistema automatizado no se puede obtener una reproducibilidad óptima en la medición del estradiol en dosis de alrededor de 30 pg/mL.
  2. En los sistemas manuales o en los automatizados, se observan desvíos hacia el mismo sentido en todos los analitos que componen los controles de calidad internos (QCI) multiparamétricos comerciales.
  3. Se detectan como en el planteo anterior, desvíos, pero solo en algunos analitos.
  4. Se observa un incremento en la concentración de los QC en todos los niveles de dosis y no se detectan modificaciones de los valores de referencia (VR) de cada analito.
  5. Se observa un incremento de los VR y QC en todos los niveles de dosis posterior a una recalibración del sistema automatizado, o cuando se realiza una nueva curva dosis-respuesta (D-R) en un sistema manual.
  6. En un sistema de RIA no se logra obtener una buena reproducibilidad en el ensayo de estradiol en dosis de alrededor de 30 pg/mL cuando se pretende trabajar con uno de los protocolos propuesto por el fabricante, de 1 hora de incubación a 37°C, en lugar de incubar 3 horas a TA, como está indicado en otro protocolo.
  7. Cuando el laboratorio procesa el mismo sistema de RIA o ELISA –la misma marca comercial– y se obtienen variaciones de la D50 e imprecisiones en el QC de baja concentración a lo largo del año.
  8. ¿Qué modificaciones en el protocolo se pueden realizar para aumentar la sensibilidad de un sistema inmunoanalítico? ¿Cuál de ellas podemos realizar en una técnica de RIA, IRMA, EIA o ELISA? ¿Qué modificaciones se pueden realizar en un sistema automatizado?
  9. ¿Qué variantes o modificaciones se pueden realizar en un sistema de RIA para obtener la sensibilidad adecuada para cuantificar T4 y fT4 en muestras de caninos, ¿Tiene validez esa curva D-R para interpolar muestras humanas? (Los caninos poseen un VR inferior en un orden de magnitud que los humanos?
  10. ¿Se puede aumentar la sensibilidad en técnicas manuales inmunométricas (IRMA o ELISA) para los analitos hTSH o PSA?

En las situaciones planteadas encontramos varios factores que pueden modificar los parámetros de las curvas D-R en técnicas manuales y automatizadas. Es sumamente importante tenerlos muy en cuenta para que los parámetros de los ensayos no sufran modificaciones indeseables, desvíos o imprecisiones –cuando se utiliza el protocolo propuesto por el fabricante– porque como consecuencia se observarán alteraciones en los resultados de los QC y en las muestras de los pacientes.

Si se requiere implementar alguna modificación se deberá conocer los factores fisicoquímicos, el comportamiento de todos los componentes y las condiciones de incubación para obtener el efecto deseado, acorde con los requisitos de calidad, como algunos factores que se citan a continuación:

  1. Temperatura y tiempo de incubación de los inmunoensayos en técnicas manuales o semiautomáticas.
  2. Concentración molar de los calibradores, control de calidad (QC) -cuyos valores fueron asignados por el fabricante para una metodología o modelo de instrumento determinado- o las muestras en el seno de los tubos del ensayo o reacción, como también lo he denominado “Sistema Termodinámico”.
  3. Efecto matriz.
  4. Efecto Hook.
  5. El cuidado especial en la reconstitución de los reactivos liofilizados o concentrados. La calidad del agua. El material volumétrico a utilizar.
  6. Consideración de la fecha de caducidad de algunos analitos componentes en los QC multiparamétricos, establecida por el fabricante.
  7. La importancia de llevar a temperatura ambiente todos los reactivos antes de cada ensayo.
  8. El especial control del pH y la fuerza iónica (FI) en la preparación de las soluciones de ensayo, diluyentes, buffers, soluciones de lavado, etcétera. Todos estos ítems son válidos para los sistemas manuales y automatizados.
  9. La importancia de no intercambiar componentes en reactivos comerciales, que incluye soluciones de lavado entre diferentes lotes del mismo reactivo –excepto que esté indicado por el asesor científico de la empresa productora o distribuidora– y, especialmente no intercambiar reactivos entre diferentes marcas comerciales.
  10. Cuando se adquiere o se desarrolla un reactivo, no se adquiere un resultado clínico y, para su correcta obtención del mismo, actúan varios factores que serán citados en este caso práctico.

Si observamos detenidamente el vídeo sobre “Método Científico y Pensamiento Crítico”, podemos afirmar que todas las leyes y suposiciones deben ser analizadas en forma crítica.

A la luz de las situaciones planteadas previamente, resultará fácil poder entender la íntima relación que tienen muchas leyes de la Física y los principios de la termodinámica con las experiencias por las que atraviesa y, con las que convive un profesional en el laboratorio clínico; especialmente con el primero y el segundo principio.

Durante cinco años he trabajado en desarrollo de técnicas inmunoanalíticas, más de veinte años en la docencia, durante quince años participé en diferentes empresas comerciales como asesor científico y comercial, y siempre me he ocupado en la búsqueda de soluciones de los problemas relacionados con estas metodologías. Así, llegué a la conclusión de que la mayoría de las soluciones dependen de muchas leyes y principios de las ciencias básicas.

Como estudiante, no me ha sido fácil –y tal vez tampoco para muchos de mis colegas– encontrar una asociación de muchos temas de las ciencias básicas con el ejercicio profesional, especialmente las leyes de la termodinámica, puesto que en el momento que las hemos estudiado –en las materias de pregrado– carecíamos de experiencias en el ámbito profesional.

Estimo que esta situación se debe a la disociación que hay entre la formación académica y la formación profesional en la bioquímica clínica. El conocimiento se define como la información puesta en contexto más las experiencias propias y de terceros; por otra parte, muchos temas fuera del ámbito académico resultaban muy difíciles poder aplicarlos o asociarlos a las necesidades específicas en el ejercicio profesional cuando aún no teníamos experiencias previas.

En el caso práctico 8, hemos visto que la unión Antígeno-Anticuerpo, como se propuso, sigue la Ley de Acción de Masas y predice la constante de equilibrio (Keq) que surge de la relación entre las concentraciones molares de los productos y los reactivos a una temperatura dada.

Cuando se llega al equilibro a una temperatura determinada, las velocidades de formación y disociación del complejo Ag-Ac se igualan; de la relación entre las constantes de velocidad de formación y disociación se obtiene la constante de equilibrio del sistema (Keq) o constante de afinidad del anticuerpo (Ka) por su antígeno específico. Esta situación puramente experimental no es otra cosa que el planteo de la primera ley de la termodinámica con respecto a la conservación de la energía.

En casos prácticos presentados se hizo mención a la potencia de un anticuerpo como la relación entre su fuerza y la concentración molar de las inmunoglobulinas. Podemos definir la fuerza o la energía de la interacción del anticuerpo y el antígeno con dos términos:

  • Afinidad. Se refiere a la magnitud termodinámica que representa la energía de interacción del sitio del anticuerpo (Paratope) que combina el único sitio del antígeno (Epitope). Representa la sumatoria de todas las fuerzas atractivas y repulsivas, y se define como la constante de afinidad (Ka) según la Ley de Acción de Masas.
  • Avidez. Representa la fuerza con la que un anticuerpo multivalente se une a un antígeno multivalente. El valor de la avidez es mayor que la suma de las afinidades individuales y se denomina constante de afinidad intrínseca promedio.

Con fines didácticos y considerando que los factores que afectan la unión Ag-Ac son los mismos –independientemente de que el anticuerpo o el antígeno sean mono o multivalentes– y por ello, utilizaré el término de Keq o Ka para facilitar su comprensión.

De muchos profesionales que trabajan en laboratorios clínicos, he acumulado muchas experiencias, y de las más diversas, una de ellas es la causa del efecto producido por variaciones de la temperatura sobre distintas reacciones o ensayos inmunoanalíticos.

Diferencias en la temperatura ambiental, en los baños, estufas o calefactores de incubación entre distintos ensayos, provocará variaciones en el equilibrio y serán por causas ajenas a la variación de la concentración del analito presente en la muestra del paciente o en los controles de calidad.

Con la variación de la temperatura, se pueden observar en casi todas las prácticas inmunoanalíticas manuales la falta en la reproducibilidad -dentro o entre los ensayos- de los valores o los resultados obtenidos, como también ocurre en las reacciones químicas y enzimáticas.

Trataré de explicar esas reacciones en forma amena y práctica mediante la segunda ley de la termodinámica, su influencia en la reacción, y especialmente sobre las cuatro fuerzas que operan en la unión Antígeno-Anticuerpo.

La exquisitez de la tecnología de los autoanalizadores permitió minimizar determinados problemas, las temperaturas y los tiempos de incubación están totalmente regulados y estandarizados.

La total automatización de los inmunoensayos proporcionó numerosas ventajas sobre las pruebas semiautomáticas o manuales porque el instrumento, los reactivos y el cálculo de los resultados le brindan un paquete totalmente integrado al profesional.

La automatización ha permitido realizar millones de pruebas de inmunoensayo con muy buena sensibilidad y excelente precisión, pero los desvíos causados por las condiciones de no equilibrio, las interferencias de los bloqueantes incorporados por los fabricantes a los reactivos y las inmunoglobulinas o anticuerpos endógenos presentes en las muestras de algunos pacientes, continúan siendo un problema (independientemente del formato o la marca comercial del inmunoensayo).

Los diferentes sistemas y las interferencias asociadas pueden conducir -acorde al los paradigmas de cada profesional- en determinados analitos, a resultados falsamente altos o bajos; es esa la razón por la que necesariamente cada laboratorio debe obtener sus propios valores de referencias para su instrumental y los reactivos, para mantener el más estricto control de calidad y la seguridad del paciente.

El análisis de los datos, su interpretación y la presentación de los informes de esos datos, potencial o teóricamente erróneos, se mantienen bajo la responsabilidad de los profesionales a cargo de los laboratorios clínicos, y por esa razón el bioquímico o analista deberá hacer docencia con el paciente y con el médico, cuando por desconocimiento de los procesos, pretendan comparar valores o resultados provenientes de diferentes metodologías o laboratorios, como se describió en el Caso Práctico 7, vinculado con el tema del control externo del estradiol. Las limitaciones citadas fueron expuestas para llamar la atención de los colegas sobre la importancia del conocimiento de los fundamentos y las leyes que gobiernan las metodologías basadas en la reacción Antígeno-Anticuerpo.

En el año 2007, la Endocrine Societyde EE.UU. publicó su posición acerca de muchas limitaciones del uso de inmunoensayos para medir testosterona. De hecho, la misma sociedad endocrinológica ha sugerido en el año 2001 que puede lograrse una mayor precisión en las concentraciones de la testosterona en las muestras de mujeres, estimadas al azar, que con la utilización de algunas técnicas inmunoanalíticas.

Personalmente no creo que sea así, si se mantiene un estricto control de las calibraciones de los sistemas inmunoanalíticos, la calidad del agua utilizada en los instrumentos, el mantenimiento adecuado del instrumento y el seguimiento de los controles de calidad en los niveles de concentraciones de testosterona bajas permitirá, como ocurre en todo el mundo, obtener un valor medianamente confiable.

En la actualidad, varios laboratorios estadounidenses y europeos establecieron que la técnica LC-Tandem-MS/MS es el "Gold Standard" para la cuantificación de hormonas como el estradiol, testosterona, DHEA sulfato, D4-androstenediona, estrona, etcétera.

A la luz de los resultados del programa de control de calidad externo del College of American Pathologists - Survey del año 2009 (Tabla 1), no se aprecian desvíos hacia un solo sentido entre todas las técnicas inmunoanalíticas con respecto a los valores de concentración de testosterona realizados con la metodología LC-Tandem-MS/MS.

Tabla 1: Fuente: Survey 2009 - Anatomic Pathology Education Program – College of American Pathologists EE.UU.

Esta técnica es muy precisa; sin embargo, no deja de ser una técnica manual, realizada con un instrumento altamente costoso (entre US$ 400.000 y 500.000), se obtienen los resultados de uno por vez; la calidad del resultado es dependiente de la pureza y la calidad de los solventes utilizados en la cromatografía. También depende de la humedad relativa y la temperatura ambiental, de la idoneidad del profesional a cargo del manejo del instrumento, etcétera.

Esta metodología podría ayudar a la reformulación de las estrategias para reducir las diferencias que se observan en los inmunoensayos en los analitos mencionados, pero es muy importante destacar que la metodología LC-Tandem-MS/MS requiere el procesamiento de cada muestra con y sin estándar interno; en consecuencia, si en las técnicas inmunoanalíticas se procediera de la misma forma, la seguridad acerca de la validez del resultado que obtendrá el profesional sería distinta. Por otra parte, el dilema se presenta si nos preguntamos qué servicio de salud, medicina prepaga o paciente estaría dispuesto a pagar ese análisis. Mi pregunta es: “¿Estamos frente a una nueva moda como tantas otras que ha habido en el diagnóstico clínico?”

No obstante, estoy convencido de que en un mediano plazo esta metodología abrirá las puertas a nuevos paradigmas.

Además, sí es seguro que la técnica cromatográfica permitirá disminuir los límites de detección en testosterona libre, obtener valores más precisos –disminuyendo el CV%– que las obtenidas por las técnicas inmunoanalíticas; por medición directa por RIA o por el cálculo o relación entre la testosterona total y la SHBG (Tablas 2 y 3).

Se puede observar también en las tablas antes citadas, los valores de la medición de la testosterona biodisponible; a la diferencia de valores de concentración de testosterona total, se le debe adicionar la diferencia obtenida entre los laboratorios por la utilización de distintas ecuaciones matemáticas para el cálculo, que provienen de distintos autores.

En este caso es conveniente recordar a los colegas que cada laboratorio deberá calcular sus propios valores de referencia y el profesional que tercerice las determinaciones mencionadas, deberá contar con los VR y el CV% para los distintos niveles de concentración obtenidos por los laboratorios de alta complejidad que las realicen y necesariamente, hacer docencia con el paciente y el médico por las diferencias entre las metodologías y los procedimientos de cálculos.

Con la simple observación de los datos expuestos en las tablas 2 y 3 podemos ver que no se requiere efectuar ningún test estadístico, –con un CV% cercano al 50%– para conocer el valor medio o la mediana en el intervalo con el 95% de confianza; es semejante a plantearnos si los controles externos –de la Argentina o de EE.UU.– o la muestra del paciente, contiene o no, testosterona libre.

Tabla 2: Fuente: Survey 2009 - Anatomic Pathology Education Program – College of American Pathologists EE.UU.

Tabla 3: Fuente: Marta Torres y Silvia Quiroga. -ProgBA – CEMIC Ronda XXIII – 2009 – Argentina.

Se debe tener presente que con la automatización podemos observar una falta de reproducibilidad de los resultados de los controles y los valores de concentración para el mismo paciente, pero en general, estos problemas o errores responden a muchos fenómenos, algunos ocasionados sin intención o malinterpretados por el profesional, otros en cambio, son producto de la propia limitación metodológica.

Es importante saber que el resultado clínico del laboratorio (gráfico 1) es la sumatoria de 5 factores:

Gráfico 1 - Fuente: Sección introductoria del Curso de Inmunoanalisis - Dr. Eduardo E. Castellani

Nótese que cuanto mayor sea el conocimiento del profesional acerca del proceso, del instrumento, los reactivos y las muestras, menor será el componente Xf o archivos secretos (he denominado Xf a alguna situación anómala que ocurre y no tenemos explicación, al menos por el momento).

A pesar de las ventajas alcanzadas por la automatización total, recordaré que hay que tener en cuenta los cambios de “paradigmas”; comprender que después de la solución de problemas, sobreviene el progreso, luego, la aparición de nuevos cambios y con ello, nuevos problemas. Todos ellos son cambios de paradigmas, un círculo virtuoso que nos otorga la ciencia de la experimentación. (Gráfico 2)

Gráfico 2 - Fuente: Sección introductoria del Curso de Inmunoanálisis - Dr. Eduardo E. Castellani

Recordar ciertos temas de las ciencias básicas y las leyes que las rigen nos permitirá entender esos cambios y poder encontrar la solución a muchos problemas. Además, reitero, un tema muy importante es seguir las especificaciones de los fabricantes de reactivos, llevar los reactivos a TA antes del proceso analítico, no realizar intercambio de diferentes lotes de reactivos que no estuviese indicado por el productor y, fundamentalmente, no intercambiar reactivos entre sistemas de diferentes marcas comerciales.

Los profesionales que en sus laboratorios no poseen la temperatura regulada y constante a lo largo del año, especialmente los que realizan técnicas semiautomáticas o manuales, como EIA, ELISA, RIA, IRMA, IFI, IFA, etcétera, incluidas las técnicas de química clínica o enzimáticas, podrán observar variaciones pero, esas variaciones pueden ocurrir también a causa del pH y la fuerza iónica de los buffers y las soluciones de lavado que, a su vez, sus valores varían con los cambios de la temperatura y afectan las condiciones del equilibrio. En muchas ocasiones, distintos fabricantes optimizan sus ensayos con soluciones reguladoras, de ensayo o de lavado con pH y FI apropiadas para sus ensayos particulares y seguramente no coinciden con los de otros analitos ni entre fabricantes.

Además, varias de las propiedades o variables termodinámicas, como el volumen, la solubilidad y la presión de vapor, aumentarán con el incremento de la temperatura y, especialmente, con la presión de vapor en época de verano o en época invernal, si el laboratorio está muy calefaccionado.

Ese incremento de temperatura tendrá una relación inversamente proporcional con las fuerzas de atracción intermolecular favoreciendo la evaporación de reactivos, los calibradores, los controles de calidad y las muestras cuando se los dejan destapados o mal acondicionados por más de 15 minutos, dependiendo de la superficie que abarca el líquido en contacto con el aire.

La evaporación de los reactivos, los controles de calidad y las muestras por la disminución de la presión de vapor por calefacción y refrigeración son producidos por la caída de la humedad relativa ambiental y por el efecto de las corrientes o turbulencias de aire que se producen en el entorno; este ítem será tratado con mayor profundidad en el próximo caso práctico acorde al concepto de sistema termodinámico y con experiencias concretas que tuvo lugar en varios laboratorios clínicos.

La unión Ag-Ac en los sistemas inmunoanalíticas competitivos es reversible a diferencia de los sistemas inmunométricos, pero en ambos casos, en técnicas manuales se debe llegar al estado de equilibrio en un determinado tiempo y temperatura de incubación que deberá ser constante, controlada y estandarizada para obtener la sensibilidad y la reproducibilidad deseada.

Muchos profesionales iniciados en técnicas radioinmunoanalíticas, recordarán numerosos protocolos de diferentes analitos como incubaciones de 1, 2 y hasta 3 horas en baño termostatizado a 37°C, desde 1 hasta 12 horas de incubación a temperatura ambiente, con y sin agitación; en otros casos, y especialmente en los primeros sistemas de RIA comerciales o desarrollados, existían incubaciones que llegaban a ser de 24 a 48 horas en heladera a 4°C.

La demanda o necesidad mundial de poder resolver miles de resultados diarios y cada vez en menos tiempo, se pudo obtener solamente por la robotización de los instrumentos y robustez de los reactivos, que brindó la posibilidad de estandarizar temperaturas y tiempos de incubación uniformes para culminar las reacciones en condiciones de preequilibrio; esa es la única forma de obtener resultados rápidos, altamente sensibles y reproducibles que las condiciones manuales no hubiesen permitido pero, las diferencias de concentración -diferencias en los valores de los CCI. CCE y valores de referencia- entre las diferentes metodologías e inclusive, las producidas entre distintos modelos de instrumentos del mismo fabricante, solo podrán ser explicados considerando al sistema inmunoanalítico como un sistema termodinámico, que desarrollaremos en el caso práctico 11.

Autor: Dr. Eduardo E. Castellani