SENSIBILIDAD DE LAS TÉCNICAS INMUNOANALÍTICAS - GENERALIDADES

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SENSIBILIDAD DE LAS TÉCNICAS INMUNOANALÍTICAS - Generalidades.

La sensibilidad de un método analítico se ha definido como la capacidad, para una metodología dada, de discernir o diferenciar pequeñas variaciones en la concentración de un analito.

En el caso de los ensayos analíticos cuantitativos para reacciones químicas o enzimáticas colorimétricas, donde se han utilizado uno (más la concentración cero como primer punto) o más estándares o calibradores de concentraciones conocidas, la respuesta de la densidad óptica (DO) o absorbancia para una longitud de onda determinada, deberá tener un comportamiento lineal en el rango de las concentraciones de interés; es decir, que en ese rango deberá cumplirse la Ley de Lambert y Beer1 y 2.

La medida de la sensibilidad del ensayo será la pendiente de la recta en la representación gráfica Dosis-Respuesta (D-R), se denominará sensibilidad de la calibración y deberá mantenerse constante en todo el intervalo de la linealidad.

El tema de ensayos analíticos cualitativos y la sensibilidad, basados en un punto de corte o cut-off se abordará en un caso práctico aparte.

Por lo expuesto, podemos inferir que la pendiente de la representación gráfica será la óptima cuando tienda a 1. Si obtenemos representaciones gráficas, en las mismas unidades de abscisas y ordenadas, las rectas obtenidas con bajas pendientes generan grandes variaciones de concentración con mínimas variaciones de respuesta (Ej. DO), que llevará a una disminución de la capacidad para diferenciar pequeñas variaciones de la concentración.

En el caso de obtener una recta en la representación D-R con pendiente muy alta, tendremos una sensibilidad muy alta; podremos discriminar mínimas variaciones de concentraciones con grandes variaciones de respuesta pero, posiblemente esas respuestas pueden limitarnos su utilidad para ciertos analitos, especialmente cuando se desea cubrir un amplio rango de interés clínico. En ese caso tendremos problemas en la calidad del resultado de concentraciones debido a la estadística de las mediciones de las respuestas en los niveles de dosis bajas y altas; por ejemplo, una mala relación de señal/ruido a dosis bajas, o respuestas que no se ajusten a la Ley de Lambert y Beer a dosis altas.

Las situaciones anteriores pueden deberse a la elección de filtros de longitudes de onda inadecuados, pero en algunas técnicas inmunoanalíticas se suele efectuar la medición con diferentes filtros para abarcar un mayor rango de concentraciones.

Además, se ha definido la sensibilidad analítica como la relación entre la pendiente (sensibilidad de la calibración) y la desviación estándar de las respuestas de cada una de las concentraciones de los estándares.

En las técnicas inmunoanalíticas manuales, se sugiere que se realicen por lo menos dos replicados de cada punto y, a diferencia de la sensibilidad de la calibración descripta en los párrafos anteriores, no es constante a lo largo de toda la curva de un sistema inmunoanalítico, pues, encontraremos las mayores imprecisiones en los extremos de las mismas, a bajas y a altas respuestas, y la zona más sensible, analíticamente hablando, es la zona media de la curva.

Por esa razón, para dos técnicas o dos ensayos de la misma técnica de igual sensibilidad de calibración, será más precisa la que tenga mayor sensibilidad analítica. Podemos aumentar la precisión aumentando el número de replicados de cada punto ya que, cuanto mayor sea el número de replicados, menor será el error estándar y obtendremos una mayor precisión en cada punto de la curva.

Todo lo explicado en los párrafos anteriores son definiciones teóricas que se analizaron en condiciones ideales y es muy difícil reproducir en la práctica, tanto intra como inter laboratorio, sin tener en cuenta todos los factores que influyen en el alejamiento de la condición ideal.

A diferencia de los ensayos como glucosa, urea, enzimas, etcétera, los ensayos de técnicas inmunoanalíticas en cuyas respuestas se mide color (EIA o ELISA), la mediciones del instrumento en DO, debe cumplir con la Ley de Lambert y Beer, es decir, una respuesta lineal del color para una longitud de onda determinada, pero es muy importante tener presente que las representaciones gráficas de las curvas D-R de estas técnicas siguen sus funciones propias y características: una curva de decaimiento hiperbólico* para los sistemas inmunoanalíticos competitivos (SIC) y una curva de incremento sigmoidal** para los sistemas inmunométricos o inmunoanalíticos no competitivos (SIM) aunque, en algunos ensayos la curva aparenta tener un formato correspondiente a incremento hiperbólico.

* En otro caso práctico se explicará cuáles son las condiciones para que la curva de decaimiento hiperbólico pueda ser definida como una hipérbola perfecta.

** También explicaremos el porqué en las representaciones gráficas de las curvas D-R en determinados ensayos SIM; podemos visualizar una función similar a un incremento hiperbólico partiendo de cero de concentración hasta el estándar de mayor concentración, mientras que la verdadera función del SIM es una sigmoidea.

Bibliografía

  1. Skoog 5ª Edición - Capítulo 13 - “Principios de Análisis Instrumental”
  2. Porro, Silvia - Publicación.Cátedra de Química II, Universidad Nacional de Quilmes.

Autor: Dr. Eduardo E. Castellani